1、二参真武汤调控 信号通路抑制心肌纤维化的体外实验研究赵研，甘芮溪，张小月，程晓昱，葛岚，彭代银，王红松，陈卫东，（安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 ；安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 ；安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥 ；中药饮片制造新技术与研发安徽省重点实验室，安徽 合肥 ；中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 ）摘要 目的探究二参真武汤抑制心肌细胞纤维化的作用机制。方法采用灌胃给予 大鼠二参真武汤、贝那普利的方法制备含药血清，从出生内的乳鼠心脏中提取原代心肌成纤维细胞，采用免疫荧光和台盼蓝染色法鉴定细胞纯度与成活率，采用 法确定二参真武汤含药血清的最佳给药浓度与给药时间
2、，采用血管紧张素（，）刺激原代心肌成纤维细胞复制心肌纤维化模型，将原代心肌成纤维细胞分为正常组、模型组、二参真武汤组、贝那普利组，采用 法检测胶原蛋白（，）和 含量，采用 法检测平滑肌肌动蛋白（，）、蛋白表达水平，法检测 、表达水平。结果提取的原代心肌成纤维细胞纯度与成活率均达到 以上。与正常组比较，模型组、含量显著升高（犘 ），、蛋白及 表达水平显著升高（犘 ）；与模型组比较，二参真武汤组原代心肌成纤维细胞中 、蛋白及 表达水平均显著降低（犘 ）。结论二参真武汤抑制心肌纤维化的机制与调节 信号通路有关。关键词 心肌纤维化；原代心肌成纤维细胞；二参真武汤；信号通路 中图分类号 心肌纤维化是心功
3、能障碍时心脏自身的代偿反应，是许多心脏疾病终末期的共同病理生理机制。纤维化的特点是成纤维细胞过度繁殖，导致细胞外基质蛋白沉积增加，虽然轻度的纤维化对心脏起到一定的保护作用，但是过度增殖和沉积会使心脏扩展下降，心脏的舒张活动降低，心肌僵硬，最终导致患者心律失常或心力衰竭。目前，还没有治疗心肌纤维化的最佳治疗方案，如果能够早发现、早对症治疗，可能会极大提高患者的生命安全。二参真武汤是安徽中医药大学第一附属医院结合多年临床用药经验，基于 伤寒论 真武汤增加红参、丹参组成的中药复方。二参真武汤能显著改善心肾阳虚型慢性心力衰竭患者心功能，降低醛固酮、活性氧、血管紧张素（，）水平。二参真武汤也可抑制免疫炎
4、症反应，抑制心肌细胞凋亡，保护心肌细胞，改善慢性心力衰竭患基金项目：省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心（教科信厅函 号）作者简介：赵研（），女，硕士研究生通信作者：陈卫东（），男，教授，博士研究生导师，者心肌纤维化。但是，其治疗心肌纤维化的作用机制仍不清楚。信号通路是一种常见的细胞信号通路，参与哺乳动物多种病理生理过程，并参与细胞周期和细胞生长的过程。有研究表明，硫化氢通过调节 信号通路，增加细胞自噬而减轻阿霉素诱导的大鼠心肌纤维化，芪参益气丸通过 通路激活自噬而减 轻 心 肌 纤 维 化，姜 辣 素 通 过 信号通路抑制细胞凋亡和自噬从而改善心肌纤维化。信号通路通过调节细胞的存活、凋
5、亡、生长及心肌收缩甚至相关基因的转录等参与调控心肌纤维化的发生、发展和病理形成，通过调节自噬减轻心肌纤维化，在心血管疾病的发病机制中具有重要的作用。基于上述原因，本实验将 信号通路相关蛋白及其 作为心肌纤维化的特异性指标，采用原代心肌成纤维细胞进行实验研究，以二参真武汤含药血清进行干预，并以贝那普利作为阳性对照，探究二参真武汤治疗心肌纤维化的机制。材料 试剂附子、红参、茯苓、白术、白芍、丹参购于 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 安徽普仁公司，生姜自制，经安徽中医药大学俞年军教授鉴定可用。贝那普利（批号 ）：中国成都地奥制药集团有限公司；胶原蛋白（，）（批 号 ）、（批 号 ）：中 国
6、 厦 门 仑 昌 硕 公 司；（批 号 ）、山羊抗兔 （批号 ）、山羊抗鼠 （批号 ）：美国 ；平滑肌肌动蛋白（，）（批 号 ）、（批 号 ）：美国 公司；（批号 ）：美国 ；试剂盒（批号 ）：日 本 ；高 糖 培 养 基（批 号 ）：美国 。仪器全波长酶标仪（）：赛默飞公司；高速冷冻离心机（）：上海天美有限公司；倒置光学显微镜（）：麦克奥迪；超灵敏多功能成像仪（）：美国；仪（）：美国安捷伦。动物将大鼠置于温度（）、相对湿度（）的环境中饲养周。本实验所用动物由河南省郑州市惠济区华兴实验动物养殖场 生产许可证号为 （豫）提供。实验程序按照 实验动物护理和使用指南 进行，并获得安徽中医药大学伦理委
7、员会批准（批文编号：）。方法 含药血清的制备按照文献 制备含药血清。采用水提回流法提取二参真武汤（丹参，白芍、焦白术、茯苓各，生姜、红参各，制附子），加入 倍量去离子水，制附子武火先煎，文火煎，再加入其他味药共煎，过滤，滤渣再加倍量去离子水，煎煮，沉降过滤后，将每次煮出的药液合并，浓缩后备用。将 只 大鼠平均分为组：空白血清组（生理盐水 ），二参真武汤含药血清组（二参真武汤 ），贝那普利组（贝那普利 ），灌胃给药，每日次，共，最后次灌胃后取血，室温放置 后，离心，取血清，水浴锅灭菌，过 滤头除菌，备用。原代心肌成纤维细胞的提取按照文献 方法提取原代心肌成纤维细胞。在无菌房内，取出乳鼠心脏剪碎，
8、加入 胶原酶，放置在冰箱静置，取上清铺板，放入 、细胞培养箱静置，等待贴壁，后取出细胞培养皿，显微镜下观察贴壁情况，贴壁细胞即为心脏成纤维细胞，后续实验使用代细胞。免疫荧光检测波形蛋白（）将第次传代的细胞以每孔 接种至装有细胞爬片的孔板上，用多聚甲醛固定。滴加一抗波形蛋白（），过夜，取出，在室温下等待 ，洗片后二抗孵育 ，洗片 ，使用透明指甲油封片，荧光显微镜观察拍照，使用美国国立卫生研究院 软件（版本号 ）进行免疫荧光分析，得到抗体阳性面积。台盼蓝染色观察细胞成活率将原代心肌成纤维细胞消化，制备成 的细胞悬液，在 细胞悬液中滴加 台盼蓝溶液，在 内使用显微镜观察计数，带有蓝色的细胞是死细胞，
9、将图片中死细胞和总细胞进行计数。细胞成活率（总细胞数量死细胞数量）总细胞数量 。细胞活力检测将原代心肌成纤维细胞置于 孔板中（每孔 个，），在标准条件下培养，用 法检测细胞活力，根据结果选择最佳的含药血清浓度。首先加入含有、含药血清的高糖培养基，培养 后，加入 试剂，每孔加，等待反应后在酶标仪 下测定吸光度。用 法检测细胞活力，根据细胞活力优选复制心肌纤维化模型所使用的 浓度和作用时间，加入含有不同浓度（、）的 培养基分别培养细胞、，每孔加 试剂，反应后在酶标仪 下测定吸光度。分组与给药将原代心肌成纤维细胞分为正常组（加入含有 空白血清的培养基）、模型组（刺激 后加入含有 空白血清的培养基）、
10、二参真武汤组（刺激 后加入含有 二参真武汤含药血清的培养基）、贝那普利组（刺激 后，加入含有 贝那普利含药血清的培养基）。检测 和 含量将原代心肌成纤维细胞以 的密度接种在孔板上，加入 含有不同含药血清的培养基刺激 后，取细胞上清液，根据 试剂盒说明书检测 和 含量。法检测 、蛋白表 达 水 平将 原 代 心 肌 成 纤 维 细 胞 以 的密 度 接 种 在孔 板 上，使 用 刺激 后分为组，加入 含有不同含 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 药血清的培养基刺激 后，配置含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液，提取细胞蛋白，每个培养皿加入 配置好的裂解液，等待 后，吸出混合液，离心，取上清，
11、上清液以 的比例加入蛋白上样缓冲液，将混合液体样品煮沸 ，蛋白定量以后进行电泳，转移到硝酸纤维素膜上，放在一抗中过夜，二抗孵育后曝光出现条带，使用 进行蛋白定量。法 检 测 、表达水平将原代心肌成纤维细胞以每毫升 个的密度接种于孔板上，使用 刺激 后分为组，加入 含有不同含药血清的培养基刺激 后，在培养皿中加入 ，提取细胞中总，将总 逆转录成 后，采用 试 剂 盒 进 行 检 测。将 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶（，）作对照。引物序列见表。表 基因引物信息引物序列（）引物长度 上游：下游：上游：下游：上游：下游：上游：下游：上游：下游：上游：下游：上游：下游：统计学方法应用 进行统计分析。连
12、续型变量采用“均数标准差（珚狓狊）”表示。呈偏态分布数据采用 犎检验；呈正态分布数据采用单因素方差分析，均数多重比较采用 检验。犘 表示差异有统计学意义。结果 原代心肌成纤维细胞的鉴定与模型复制免疫荧光检测原代心肌成纤维细胞标志性蛋白 ，结果显示 单抗染色阳性大于（见图）。台盼蓝染色检测原代心肌成纤维细胞的存活率，根据计数得知细胞存活率在 以上（见图）。分别采用含有、的 培养基刺激细胞、，结果显示 刺激细胞 后细胞活力最强（犘 ）（见图）。采用 法检测纤维化标志物 、蛋白的表达水平（见图），结果显示模型组（刺激 组）、蛋白表达水平显著高于正常组（刺激 组）（犘 ），说明心肌细胞纤维化模型复制成
13、功。注：被 染色的细胞核；被 染色的细胞质；同时被 和 染 色 的 细 胞 核和细胞质图 原代心肌成纤维细胞纯度（免疫荧光染色，倍）图 原代心肌成纤维细胞成活率（台盼蓝染色，倍）注：与 组比较，犘 ；与 刺激组比较，犘 图不同浓度 刺激（）和 刺激不同时间（）后原代心肌成纤维细胞成活率比较（珚狓狊，狀）：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 注：正常组（刺激）；模型组（刺激）；与正常组比较，犘 图原代心肌成纤维细胞中 、蛋白表达水平比较（珚狓狊，狀）二参真武汤含药血清的最佳浓度随着二参真武汤含药血清浓度升高，原代心肌成纤维细胞活力降低，由于 和 二参真武汤含药血清的抑制作用过强，对原代心肌成
14、纤维细胞的伤害过大，故选择 二参真武汤含药血清进行后续实验。见图。注：与不含二参真武汤含药血清组比较，犘 图不同剂量二参真武汤含药血清组原代心肌成纤维细胞活力比较（珚狓狊，狀）法检测的组原代心肌成纤维细胞中 和 含量比较模型组 和 含量显著高于正常组（犘 ），经过 二参真武汤含药血清处理后，和 含量显著降低（犘 ）。见图。注：正常组；模型组；二参真武汤组；贝那普利组；与正常组比较，犘 ；与模型组比较，犘 图组原代心肌成纤维细胞中 、含量比较（珚狓狊，狀）检测的组原代心肌成纤维细胞中 、表达水平比较模型组 、表达水平显著高于正常组（犘 ），经过 二参真武汤含药血清处理后，、显著降低（犘 ）。见图
15、。注：正常组；模型组；二参真武汤组；贝那 普 利 组；与 正 常 组 比较，犘 ；与模型组比较，犘 图组 、相对表达水平比较（珚狓狊，狀）检测的组原代心肌成纤维细胞中 、蛋 白 表 达 水 平 比较模型组 、蛋白表达水平显著高于正常组（犘 ），经过 二参真武汤含药血清处理后，、蛋白表达水平显著降低（犘 ）。见图。注：正常组；模型组；二参真武汤组；贝那普利组；与正常组比较，犘 ；与模型组比较，犘 图组原代心肌成纤维细胞中 、蛋白表达水平比较（珚狓狊，狀）检 测 的组 原 代 成 纤 维 细 胞 中 、表达水平比较模型组 、表达水平均显著高于正常组（犘 ）；经过 二参真武汤含药血 ：安徽中医药大学
16、学报 第 卷 第期 年月 清处理后，、表达水平均显著下降（犘 ）。见图。注：正常组；模型组；二参真武汤组；贝那 普 利 组；与 正 常 组 比较，犘 ；与模型组比较，犘 图组原代成纤维细胞中 、表达水平比较（珔狓狊，狀）讨论心肌纤维化的主要特征是细胞外基质蛋白在心肌中过度沉积，导致 的过度表达和胶原的产生，主要为 与 比值增加。心肌纤维化可使心肌兴奋收缩耦联失调，损害收缩和舒张功能，从而加快心脏疾病的进展，导致心力衰竭。心脏病尤其是心力衰竭患者心肌纤维化严重程度与死亡率相关。本研究使用 刺激原代心肌成纤维细胞建立细胞模型作为研究对象，结果表明，二参真武汤可 以降低 心肌纤 维 化 细 胞 的 标 志 因 子 、的表达水平，产生这种结果的原因可能是二参真武汤可以减少胶原纤维的产生和沉积，抑制心肌成纤维细胞激活，减轻心肌纤维化，二参真武汤可以降低心肌纤维化细胞 信号通路相关蛋白和 表达，改善心肌纤维化。二参真武汤的有效成分含有三七皂苷，丹参酮，芍药苷，人参皂苷 、。三七皂苷 可以 增 加 细 胞 自 噬，减 少 细 胞 增 殖，是 调 控 信号通路实现的。丹参酮可抑制 信号通路，增强自噬，
