1、基金项目：国家自然科学基金项目（，），内蒙古自然科学基金项目（）；包头医学院花蕾计划（）通讯作者：巴德仁贵【基础医学】黄芪甲苷通过 甲基化调节 参与急性低氧脑损伤的保护作用杨海霞，靳庆玲，林家静，谢伟，鲍牧兰，巴德仁贵 包头医学院医学技术与麻醉学院（内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室），内蒙古 包头 ；包头医学院基础医学与法医学院 摘要 目的：研究黄芪甲苷（）通过影响 甲基转移酶表达变化来上调血管内皮生长因子 （）表达水平减轻急性低氧造成的脑损伤。方法：以小鼠海马神经元细胞（细胞）为研究对象，分为对照组（）、低氧组（）和黄芪甲苷处理组（）。将 细胞低氧 复氧 构建低氧模型，组于复氧的同时给与
2、的黄芪甲苷药物处理。荧光倒置显微镜观察细胞形态变化；采用 检测 甲基化转移酶 （）、甲基化转移酶 （）、甲基化转移酶 （）、在 水平上的表达变化；采用蛋白免疫印迹法（）检测 、在蛋白水平上的表达变化。结果：与对照组相比，低氧后，细胞胞体变小，触角变短。、的 水平和蛋白水平均有所下降（），则表达上升（），的 水平下降（）。与低氧组相比，给予 治疗后细胞形态有所改善。、的 水平和蛋白水平均无变化，则有所降低（），的 水平上升（）。结论：黄芪甲苷可以下调低氧后 的表达水平，发挥神经保护作用，这一保护机制可能是通过上调 的表达来发挥的。关键词 急性低氧；脑损伤；黄芪甲苷；甲基化转移酶；血管内皮生长因子
3、 ：，（，；，）：（）（）年第 卷第 期 ：（），（）（），（），（），：，（），（），（），（），（）：，；低氧（）是高原、航天航空、潜水等常面临的生命威胁的致病原因。脑是人体极为复杂的生命器官，大脑耗氧量约占机体总耗氧量的 ，极容易受到缺氧的影响 。急性低氧通常引起脑水肿的发生，使脑组织能量供应不足，脑部能量代谢发生障碍。即使在缺氧缺血之后幸存的未成熟的神经元仍有受损的神经突生长和突触形成 。更有甚者引起神经元损伤，乃至凋亡。引起各种神经退行性疾病以及一系列的神经系统症状。黄芪甲苷（，）是中药黄芪根中的主要活性化合物，具有免疫调节、抗炎、抗凋亡、神经保护、血管重构等多种药理作用 。有研究发
4、现 可以上调小鼠脑中的血管内皮生长因子 （，）的表达水平来促进血管新生 ，但 的调控机制还不明确，有待进一步研究。甲基化是哺乳动物体内广泛存在的一种表观遗传方式。正常水平的 甲基化可以维持机体内环境稳态，而当 甲基化水平增高或降低时则会导致神经元细胞损伤 。不仅如此，甲基化在神经再生和重塑过程中也发挥重要作用 。有研究发现，在低氧条件下，脑组织内的 甲基化水平会发生异常升高或降低 ，导致神经损伤发生。常见的调控 甲基化水平的酶是 甲基化转移酶 （，）、甲 基 化 转 移 酶 （，）、甲基化转移酶 （，）。而相关研究表明黄芪甲苷具有神经保护的作用，那么这种保护作用是否是通过改善相关保护因子启动子
5、区域的甲基化水平实现的，有待研究证实。是一种血管内皮生长因子，可以促进血管生成和调节血管生成中的细胞增殖、迁移存活和血管通透性 ，。各种研究证实 对中枢和周围神经系统有直接的保护作用 。缺氧可以通过缺氧诱导因子（，）调节 的表达。但是黄芪甲苷是否可以通过调控 甲基化调控 的表达来发挥神经保护作用？这一调控机制尚不清楚。因此，本文通过研究黄芪甲苷对急性低氧后细胞的 表达水平的调节来探究这一机制，为后续进一步研究黄芪甲苷的神经保护机制提供更多依据。材料与方法 主要仪器低温离心机（，），恒温摇床（恒温冷摇床，公司），年第 卷第 期 酶标仪（酶标仪，公司），金属浴（，杭州奥盛仪器有限公司），电泳仪（公
6、司），转膜仪（，公司），实时荧光定量 仪（，公司），荧光倒置显微镜（，公司），二氧化碳培养箱（，公司）。药品与试剂黄芪甲苷，购自上海麦克林生化科技有限公司，规格：，纯度 ，货号：；小鼠的海马神经元细胞（细胞，北京协和细胞中心）；浓度定量试剂盒（美国 公司）；抗氧化剂（美国 公司）；膜（中国 公司）；、吐温 （中国利维宁公司）；裂解液（美国 公司）；反转录试剂盒、引物（上海生工生物有限公司）；、一抗（稀释，）、孔板、二抗、（美国 公司）。药品的处理称取 溶于 的 中，用适量 定容，混匀，配制成 的母液，保存。后续使用时按梯度稀释 倍得到工作液。细胞培养、分组与给药将 细胞置于 的胎牛血清及 青霉
7、素 链霉素混合溶液的 培养基中，在 、的培养箱中培养。收集对数生长期细胞，分为对照组（）、低氧组（，低氧 复氧 ）、黄芪甲苷组（，低氧 后于复氧的同时给予 处理）。荧光倒置显微镜观察不同分组细胞形态变化将 的细胞悬液接种于直径 的培养皿中，、预培养 。待细胞完全贴壁后，将低氧组和黄芪甲苷组细胞置于低氧盘里低氧 ，低氧组复氧 后置于荧光倒置显微镜下观察细胞形态，黄芪甲苷组于复氧的同时给予 的黄芪甲苷处理，后置于荧光倒置显微镜下观察细胞形态变化。并利用胰酶消化处理收集细胞置于 保存以供后续实验。向细胞沉淀中加入 ，按照说明书步骤利用 法提取总 ，使用利维宁公司反转录试剂盒将 反转录为 ，保存。引物
8、由上海生工生物有限公司合成 、和 基因，引物的设计见表 。表 基因引物序列引物名称引物序列 检测相关蛋白的表达水平 裂解液裂解细胞并向其中加入蛋白酶抑制剂，离心 ，收集上清液即为蛋白原液。法检测蛋白浓度，并向蛋白原液中加入相应比例的抗氧化剂和 ，金属浴 。蛋白上样量为 ，进行 电泳，后转移至 膜上，脱脂牛奶室温孵育 ，的 洗 次。过夜孵育 、一抗（稀释）。回收一抗，的 洗 次，分别用驴抗兔、山羊抗鼠二抗室温孵育 ，的 洗 次。用 发光液浸泡，化学成像仪检测、分析。统计分析使用 统计软件进行数据处理分析，计量资料用（）表示，组间差异应用配对 检验进行比较，以 为差异有统计学意义。结果 细胞在不同
9、状态下形态变化荧光倒置显微镜下观察到 组 细胞数量多且胞体大而亮，贴壁紧密，细胞膜边界清晰，触角细长，细胞与细胞之间以触角连接。与 组相比，年第 卷第 期 组细胞胞体变小，整体晦暗无光，细胞数目减少，且贴壁性不好，细胞膜边界模糊，细胞触角变短，细胞与细胞之间聚团出现。与 组相比，组细胞有所改善，胞体稍大，细胞触角变长，细胞数目中等，贴壁性良好，死亡细胞数目减少。见图。图 细胞不同状态下形态变化注：组；：组；：组 不同处理组 细胞中的 在 表达水平上的变化与 组相比，组 细胞中的 、表达下降（），表 达 上 升（）。与 组相比，组 、表达无变化（），表达下降（）。见图 。图 不同处理组 细胞中
10、在 表达水平上的变化注：，：，：；，不同处理组 细胞中的 在蛋白表达水平上的变化与 组相比，组 细胞中的 、蛋白表达量下降（），蛋白表达上升（）。与 组相比，组 、蛋白表达无变化（），蛋白表达下降（）。见图 。不同处理组 细胞中的 在 表达水平上的变化与 组相比，组 细胞中的 表达下降（）。与 组相比，组 表达上升（）。见图 。图 不同处理组 细胞中 在蛋白表达水平上的变化注：，：，：；图 不同处理组 细胞中 在 表达水平上的变化注：讨论氧气的存在对于大脑的正常工作十分重要，因为它是能量产生必备因素，脑组织对能量的需求是极大的 。当缺氧时，不仅会引起脑组织水肿，活性氧增多，长期缺氧也会导致有缺
11、陷的血管生成，而这种血管会限制血流量，使向大脑输送的营养物质和氧气减少，导致神经系统残疾 。当机体缺氧 年第 卷第 期 时，机体激活 转录家族，其中 在调节血管内皮生长因子中起着重要作用。和其他缺氧调节因子包括表皮生长因子（，），血小板衍生生长因子（，）协调 的表达，进而调节 驱动的信号 。在本文结果中，低氧 ，复氧 之后，细胞中的 表达水平下降，可能是因为缺氧时间已经超过了神经元细胞的代偿能力。在神经元失代偿的情况下，已经对神经元细胞造成了不可逆的损伤。大量文献证明缺氧会引起许多基因不同程度的甲基化。等人 通过 发现，在缺氧后四天细胞状态有所恢复，并且大部分基因启动子区域的 甲基化减少，相关
12、基因表达上调。与之相对应的是，在急性缺氧后细胞的神经元树突长度显著低于对照组，许多基因启动子区域的甲基化水平升高，并且随着缺氧时间的增加而增加 。等人 研究发现，对 细胞给予氧糖剥夺刺激时，引起神经元细胞中的 积累，而引起这一结果是因为 甲基化。同样有研究证实，抑制 甲基化可以保护神经元免受缺血再灌注损伤 黄芪甲苷作为一种中药成分，被人们广泛应用治疗各种疾病。大量文献证明它可以促进神经突触再生，增加血脑屏障通透性 。它不仅具有神经保护作用，而且在心血管、肾、肺、抗肿瘤等方面都发挥重要作用 ，。等人 通过研究证实黄芪甲苷不仅可以消除缺血脑中 细胞介导的对缺氧葡萄糖剥夺神经元的溶细胞杀伤，还通过
13、抑制脑缺血后 细胞的浸润和激活，发挥对急性缺血性脑损伤的保护作用。不仅能促进血管再生，还可以在体内体外广泛地促进神经发生，神经元迁移和存活。等人 研究发现 可以增加神经突数目、长度和大小。可以独立于神经胶质直接影响神经元。而且许多体内实验也证实了 在调节神经祖细胞增殖、存活、迁移、轴突 树突状结构和突触功能中的直接和重要作用。本研究发现，黄芪甲苷处理后 表达量上升，这表明，黄芪甲苷可能是通过上调 的表达来保护小鼠的海马神经元细胞。甲基化是一种经过充分研究的表观遗传变化，高甲基化导致转录抑制，而低甲基化导致转录激活 。等人 研究发现低氧 和 和 启动子区域的甲基化水平明显低于常氧组，与之相应的是
14、 和 的表达水平高于常氧组。尽管结果与本研究有所出入，但是都表明低氧确实会引起 启动子区域的甲基化水平发生改变。不过低氧时间的长短不同也可能导致基因的表达水平发生变化。本研究发现，低氧时 表达升高，而黄芪甲苷处理后 表达下降，与之对应的是 在低氧后表达下降，黄芪甲苷处理后表达上升。结果提示，黄芪甲苷的作用机制有可能是通过下调 启动子区域的甲基化水平来实现的。但这一保护机制仍然十分复杂，需要今后进一步探究验证。参考文献 ，：？，：，（）：，：，：，（）：，（）：（下转第 页）年第 卷第 期 ，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：郝广煜，方刚，代玉晶，等人参皂苷 对 诱导 细胞损伤的保护作用 包头医学院学报，（）：，（）：（收稿日期：櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂）（上接第 页），（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，：（收稿日期：）年第 卷第 期
