1、876安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 10：23：01 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1342.029.h t ml口腔医学研究Sirtl促进炎症牙周膜干细胞成骨分化的机制孔祥伟，尹伟,王晨辰，张林,程义成摘要 目的 探讨去乙酰化酶1(Sir t l)对炎症牙周膜干细 胞(P DLSCs)成骨分化的作用,并研究其可能的分子机制。方法 分离、培养正常及炎症P
2、DUCs,观察Sir t l在两种细 胞中的表达;将炎症P DUCs进行成骨诱导，同时使用Sir t l 激动剂白芦藜醇上调炎症P DUCs中的Sir t l,观察炎症 P DLSCs的成骨分化情况,West er n bl o t检测Ru n x 2、乙酰化 NF-kB、乙酰化Fo x Ol和Fo x Ol的表达。结果 炎症P DUCs 中Sir t l的表达较正常P DUCs减少(P 0.01)；白芦藜醇可 上调炎症P DLSCs中Sir t l的表达;与成骨诱导组比较，成骨 诱导+白芦藜醇组炎症P DLSCs中BSP(f=14.045,P 0.01)、Ru n x 2(t=3.349,P
3、 0.01),OCN(t=7.218,P 0.01)和 Osx(=4.544,P 0.01)mRNA 的表达增加，ALP 染色增强(P 0.01)；炎症P DLSCs成骨诱导后Fo x Ol(t=&737,P 0.01)和 Ru n x 2(i=6.152,P 0.01)的表达增强；使用白芦藜醇上调Sir t l的表达后，Fo x Ol(t=5.912,P 0.01)和Ru n x 2(t=6.277,P 0.01)的表达较成骨诱导组进 一步增加,而乙酰化NF-kB(F=184.033,P 0.01)和乙酰 化Fo x Ol(F=301.454,P 0.01)的表达较对照组和成骨诱 导组明显降
4、低。结论 去乙酰化酶Sir t l可以通过去乙酰化 NF-kB和Fo x Ol，从而促进炎症P DLSCs的成骨分化。关键词 去乙酰化酶Sir t l;炎症牙周膜干细胞;成骨分化 中图分类号 R 781.4+2文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0876-05 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.030牙周膜干细胞(per io d o n t a l l ig a men t st em c el l s,P DLSCs)在牙周组织再生修复中发挥重要作用。然而，炎症P DLSCs的再生功能受损,给牙周炎患者
5、使用自体P DLSCs治疗带来困难2-3o细菌感染和 慢性炎症会导致细胞发生表观遗传修饰的改变，从 而导致再生能力的下降。去乙酰化酶1(Sir t u in 1,Sir t l)在多细胞有机体中广泛存在,通过将组蛋白去 乙酰化，参与多种生命过程。Sir t l也是骨密度的2022-12-09 接收基金项目：国家自然科学基金(编号:81901046)；江苏省自然科学基 金(编号:BK20170115)作者单位:东部战区总医院口腔科，南京210002作者简介:孔祥伟，女，主治医师；程义成，男，副主任医师，责任作者，E-ma il:c h en g y-ic h en g 0220 163.c o
6、m重要调节因子。但Sir t l对炎症P DLSCs成骨分 化的影响及其机制尚未见相关研究报道。该研究在 炎症P DLSCs成骨诱导过程中使用Sir t l激动剂白芦 藜醇上调细胞中的Sir t l,观察Sir t l对炎症P DLSCs 成骨分化的影响；同时，检测叉头框蛋白0(f o r k h ea d bo x 0 pr o t ein,Fo x O)和核内转录调节因子kB(n u c l ea r f a c t o r-Kb,NF-kB)的表达，明确Sir t l调控炎症 P DLSCs的分子机制可以为恢复疾病状态下干细胞 的再生能力提供理论依据。1材料与方法11主要试剂与仪器DME
7、M培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、P BS(美国Gibc o公司)；I型胶原 酶、胰蛋白酶、甘油磷酸钠、地塞米松、LP S(美国 Sig ma公司)；白芦藜醇(美国Sel l ec k c h emic a l s公 司)；谷氨酰胺、TRIzo l Rea g en t(美国 In v it r o g en 公 司)；BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒、RIP A细胞 裂解液.Br a d f o r d蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天 生物技术有限公司)；逆转录试剂盒、实时荧光定量 P CR试剂盒(日本Ta k a r a公司)；Sir t l抗体、Ru n x 2 抗体(美国Cel l
8、 Sig n a l in g公司)；乙酰化NF-kB抗 体、乙酰化Fo x Ol抗体、Fo x Ol抗体(美国Abea m公 司)；3-a c t in抗体(江苏康为世纪生物技术有限公 司)；ECL发光试剂盒(美国P ier c e公司);7500型快 速实时荧光定量P CR仪(德国Appl ied Bio sy st ems公 司)；倒置相差显微镜(日本Ol y mpu s公司)；JS-860A自动凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)。1.2正常与炎症PDLSCs的分离和培养正常 P DLSCs来自于健康个体，年龄20-35(2&00 3.53)岁;炎症P DLSCs来自于慢性牙周炎患者，年
9、 龄31-40(35.00 4.27)岁。两种组织均来自于因 正畸需要而拔除的、无嶠坏的前磨牙。用无菌手术 刀片刮取牙齿根中1/3的牙周膜组织，接种至6孔 板内，每隔3 d更换培养液，直至有细胞从组织块边 缘爬出。细胞生长达80%汇合时胰酶消化传代。取第3 5代细胞用于本实验研究。13成骨诱导分化 取炎症P DLSCs制备细胞悬 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)877液，以2 x IO。/孔的密度接种于6孔板中，在细胞达 到70%汇合后，将培养液更换为成骨诱导液(含5%胎牛血清的DMEM,地塞米松0.1
10、mo l/L,p-甘油磷 酸钠 0.01 mo l/L,维生素 C 5 X10-5 mo l/L),每隔 3 d换液。倒置相差显微镜下观察，细胞呈复层生长 并出现圆形结节。实验分为4组，对照组:炎症 P DLSCs；白芦藜醇组:炎症P DLSCs+白芦藜醇;成骨诱导组:炎症P DLSCs+成骨诱导；成骨诱 导+白芦藜醇组:炎症P DLSCs+成骨诱导+白芦藜 醇。1.4 ALP染色 吸弃培养液,P BS洗涤,4%多聚 甲醛固定1 h,P BS洗涤后，每孔加入1 ml BCIP/NBT工作液，室温避光放置30 min,吸弃工作液,P BS洗涤，显微镜下拍照。1.5 实时定量PCR检测收集培养的炎
11、症 P DLSCs,加入TRIzo l Rea g en t裂解细胞，提取总 RNA。反转录操作步骤按照反转录试剂盒的说明书 进行。进行反转录反应后，将得到的c DNA模板按 照 SYBR P r emix Ex Ta q TM II(Ta Ka Ra Co d e：DRR081)操作说明书加入检测体系，使用ABI 7500 实时定量仪进行Rea l-t ime P CR反应。检测ALP、Ru n x 2、OCN和Osx的表达,p-a c t in为内参。弓|物序 列由上海生物工程公司设计合成，见表1。表1引物序列基因引物序列ALPF：5 l GGACCATTCCCACGTCTTCAC-3R：
12、5-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3Ru n x 2F：5 LCCCGTGGCCTTCAAGGT-3R：5-CGTTACCCGCCATGACAGTA-3OCNF：5-CCCAGGCGCTACCTGTATCAA-3 R：5 t GGTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3OsxF：5 z-CCAGAAGAACTGGTAGATCAGCAA-3R：5-CGCCATACTCGAACTGGAATC-3Sir t lF：5=CCCAGAACATAGACACGCTGGA3R：5-ATCAGCTGGGCACCTAGGACA-3p-a c t inF：5 l TGGCACCCAGCACAATGA
13、A-3R：5-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-31.6 Western blot检测 使用RIP A裂解液提取细 胞蛋白。使用Br a d f o r d蛋白浓度测定试剂盒测定蛋 白浓度。按照4:1的比例加入5 X l o a d in g bu f f er,100 C a5 min水煮变性。将蛋白样本用1 X l o a d in g bu f f er调整到同一体积。进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳，电泳停止后切胶、转膜。5%牛血清白蛋白室温 封闭2 h。封一抗,4弋过夜。复温1 h后洗膜液冲 洗3次，放入二抗，室温孵育l h。ECL发光液A：B=1:1混合，注意避光，均匀滴
14、加在膜上，放入JS-860A自动凝胶成像仪曝光。用Qu a n t it y On e软件分 析各条带的灰度值，以3-a c t in为参照，计算相对灰 度值。1.7统计学处理 采用SP SS 20.0统计软件进行 数据分析，以上实验均重复3次,实验数据均以x s 表示，两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因 素方差分析。P 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 Sirtl在正常PDLSCs和炎症PDLSCs中的表 达通过有限稀释法获取人正常和炎症组织来源的 P DLSCs,West er n bl o t检测两种P DLSCs中去乙酰化 酶Sir t l的表达情况。West er n
15、 bl o t结果显示，在正 常P DLSCs中Sir t l的蛋白表达水平较高，而在炎症 P DLSCs中Sir t l的表达受到抑制，差异有统计学意 义(t=5.237,P 0.01)。见图 1。a b图 1 Western blot 检测 Sirtl在正常PDLSCs和炎症PDLSCs中的表达a：正常 P DLSCs；b：炎症P DLSCs；与正常 P DLSCs 比较:*P 0.012.2白芦藜醇对炎症PDLSCs成骨分化的影响 在培养的炎症P DLSCs中加入Sir t l激动剂白芦藜 醇，实时定量P CR和West er n bl o t检测Sir t l的表达。结果表明，白芦藜醇
16、可增加炎症P DLSCs中Sir t l的 表达。将炎症P DLSCs进行成骨诱导，同时使用白 芦藜醇上调炎症P DLSCs中的Sir t l，诱导3 d后实时 定量 P CR 检测 BSP、Ru n x 2、0CN 和 Osx mRNA 的表 达，诱导7d后进行ALP染色。实时定量P CR结果 显示，与成骨诱导组比较,在成骨诱导时加入白芦藜 醇可增加 BSP(t=14.045,P 0.01)、Ru n x 2(t=3.349,P 0.01)、OCN(t=7.218,P 0.01)和 Osx(i=4.544,P 0.01)mRNA 的表达。ALP 染色结果 表明，成骨诱导+白芦藜醇组的ALP染色较成骨诱 导组增强(t=l l.513,P 0.01)，说明白芦藜醇可增 强炎症P DLSCs的成骨分化。见图2、表2。878 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)A 5Ba bD*Me!VNamds0*glvNHmzxunM*#8If*炊wglvNMHI xso图2实时定量PCR和Western blot检测
