1、安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)753网络出版时间：2023-04-21 10：28：04 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1339.009.h t mlWnt2/p-catenin通路在C57BL/6小鼠肝再生修复中的变化姚路远匕刘云蔦杨茜匕鲍欣j王琰j赵小英j唐俊明|摘要 目的 探讨Wn t 2/0-c a t e n in通路在C57BL/6小鼠肝 再生修复中的变化特征。方法 将C57BL
2、/6雄鼠随机分为 假手术组(Sh a m组)、术后1 d组、术后2 d组、术后4 d组、术后6 d组、术后8 d组，手术组小鼠行部分肝切除术(P Hx)，分别切除肝左叶和中叶。于术后第1、2、4、6、8天收 集血浆和肝脏组织，丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸 氨基转移酶(AST)生化分析试剂盒检测血浆ALT和AST活 力;免疫组化检测各组Ki67阳性细胞数目；免疫荧光检测 HNF4-a和Ki67双阳性细胞数、LYVE1和Ki67双阳性细胞 数及p-c a t en in入核细胞数;West er n bl o t检测各组Wn t 2蛋白 的表达，分析其在肝再生过程中表达的时间特征。结果
3、P Hx后第6天肝质量、肝质量/体质量达到高峰，接近Sh a m 组水平。P Hx后第1天肝损伤严重，第4天即可恢复正常。P Hx后第2天主要是肝细胞增殖，第4、6天主要是肝窦内皮 细胞增殖，同时Wn t 2/p-c a t en in通路被激活。结论肝脏有 强大的再生修复功能，与肝实质细胞和肝窦内皮细胞的快速 增殖密切相关,Wn t 2/p-c a t e n in通路在小鼠肝脏再生修复中 被激活。关键词 肝部分切除术;肝再生修M；Wn t 2；p-c a t en in中图分类号 R 363.1文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0753-07 d o i:10.19
4、405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.009肝再生是一个复杂的过程,涉及肝脏中的多种 细胞类型，包括肝细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞(l iv er sin u so id a l en d o t h el ia l c el l s,LSEC)和 Ku pf f er 细胞等。肝细胞是主要的实质细胞，占肝功能的 很大一部分。健康的肝脏中细胞有丝分裂是静 止的,但在受损伤或切除后,细胞可以迅速进入细胞2022-12-01 接收基金项目：国家自然科学基金(编号=82270299);湖北省科技计划项 目(编号：2021DFE026)作者单位J湖北医药学院基础
5、医学院,湖北省胚胎干细胞重点实验 室，十堰 4420002十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)麻醉科，十堰 442000作者简介:姚路远,男,硕士研究生；唐俊明，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-ma il：t a n g jm416 163.c o m周期，恢复肝脏的质量和功能。在肝再生过程中，肝 实质细胞和LSEC密切配合促进肝脏质量和功能的 修复。Wn t基因最初来源于小鼠乳腺癌中的整合 酶-1和果蝇的无翅基因,Wn t通路也被称为Wn t 2/P-c a t en in 通路，涉及 p-c a t en in 的核转位。p-c a t en in 进入细胞核与TCF/LEF转录因子
6、激活靶基因，该通 路主要控制细胞增殖。既往研究表明Wn t 2/p-c a t en in通路在肝脏发育、稳态和代谢中起着关键作 用,但其在肝脏再生修复中的作用尚不清楚。该研 究旨在探讨小鼠部分肝切除术(pa r t ia l h epa t ec t o my,P Hx)后，肝再生修复过程中Wn t 2/p-c a t en in的表达 特征及作用，为临床中P Hx后的患者改善肝脏功 能,降低术后病死率提供理论基础和新的靶标。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物11周龄C57BL/6小鼠，雄性，体 质量24 30 g,购自湖北医药学院实验动物中心，饲 养于SP F环境中，动物许可证号SY
7、XK(鄂)2019-0031,湖北医药学院实验动物伦理委员会批准批 准号:湖北医药学院动(福)第2021-实029号。112 主要试剂 异氟烷购自美国RWD公司；TRIzo l购自美国Ambio n公司；丙氨酸氨基转移酶(a l a n in e a min o t r a n sf er a se,ALT)生化分析试剂盒、天 门冬氨酸氨基转移酶(a spa r t a t e a min o t r a n sf er a se,AST)生化分析试剂盒购自南京建成生物技术研究 所;组织自发荧光淬灭剂A液、B液购自武汉赛维尔 生物科技有限公司；防淬灭封片剂购自美国So u t her n Bi
8、o t ec h公司；苏木精购自武汉赛维尔生物科技 有限公司；An t i-LYVEl Ra bbit pAb、An t i-HNF4-a Ra bbit mAb 购自英国 Abea m 公司；An t i-Ki67 Mo u se mAb购自武汉赛维尔生物科技有限公司;An t i-GAP-DH Mo u se pAb 购自美国 Bio w o r l d 公司。HRP Go a t An t i Ra bbit Ig G H+L、HRP Go a t An t i Mo u se Ig G H+L购自武汉安特捷生物技术有限公司;荧光二抗A1-ex a Fl u o r 594 Do n k
9、 ey An t i-Mo u se Ig G H+L、Al ex-a Fl u o r 488 Do n k ey An t i-Ra bbit Ig G H+L 购自美国 Ja c k so n Immu n o Resea r c h 公司；P MSF 购自大连美仑 754 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)生物技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒购自南京 诺唯赞生物科技股份有限公司;ECL试剂盒购自美 国Mil l ipo r e公司;RIP A购自大连美仑生物技术有限 公司；DAP I购自美国Sig
10、 ma公司。1.2方法1.2.1 小鼠肝切除再生模型构建 11周龄 C57BL/6雄鼠随机分为6组,Sh a m组、术后1 d组、术后2d组、术后4 d组、术后6 d组、术后8 d组，手 术均在SP F环境中操作。术前称体质量，用异氟烷 麻醉后，将小鼠置于保温垫上，胶带固定四肢。用碘 伏消毒腹部3遍，横切口打开腹腔，分别用棉签暴露 出肝左叶和中叶，用棉线结扎肝左叶和中叶根部并 切除。检査残端无出血后，用4#手术缝合线迅速缝 合伤口,Sh a m组仅腹腔切开后缝合处理。1.2.2 肝功能检测 行P Hx后,于术后1、2、4、6、8 d取材，小鼠经吸入异氟烷麻醉后，心尖取血，经4 C,3 500
11、r/min离心10 min后，收取血浆，利用南京 建成公司AST、ALT试剂盒检测血浆中肝功能指标 AST、ALT水平变化,分析术后小鼠肝功能情况。12.3免疫组化染色组织依次固定、脱水、透明、浸蜡、包埋，组织切片5 pjn。将切片脱蜡、复水后置 于pH6.0枸椽酸钠中，放入微波炉抗原修复。P AP 阻水笔画圈后每个组织加30以3%过氧化氢去除 内源性过氧化物酶,P BS洗涤3次，每次5 min0含 0.3%Tr it o n X-100的5%山羊血清封闭液室温封闭 1 h,去除封闭液后，于每组切片分别滴加30|il 一抗 An t i-Ki67(l:600),湿盒内4咒孵育过夜。放入室 温复
12、温30 min后用含0.1%吐温-20的P BS溶液洗 涤3次，每次5 mino用山羊抗小鼠二抗(1:600)室 温孵育1 h,P BST洗涤3次，每次5 mino DAB染色 后超纯水冲洗5 min,苏木精复染核1.5 min,超纯水 冲洗10 mino 1%盐酸乙醇分化5 s后超纯水洗,P BS返蓝后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封 片。12.4免疫荧光染色 将上述组织抗原修复后，用 组织自发荧光淬灭剂A液30 jil室温孵育30 min,超纯水冲洗5 mino用5%驴血清室温封闭1 h,抗 An t i-Ki67(l:600)、An t i-HNF4-a,(l：2 000)、An t
13、 i-LYVEl(1:1 000)、An t i-|3-c a t en in(1:100),4 弋孵育过夜。放入室温复温30 min后用P BST溶液 洗涤3次，每次5 mino加入荧光二抗(1:500)室温 孵育 1 h,P BST洗3 次，每次5 min,DAP I(1:2 000)复染细胞核5 min。P BST洗3次，每次5 min,滴加 组织自发荧光淬灭剂B液30“I室温避光孵育5 min,超纯水冲洗5 min,P BS中洗涤3次，每次5 min,切片稍甩干后滴加防淬灭封片剂封片。1.2.5 West er n bl o t检测Wn t 2的表达变化特征 取各时间点肝脏组织50 m
14、g于EP管中，加入RIP A 和 P MSF 混合物 500 pil(RIP A:P MSF=100：1),多 通道组织匀浆机匀浆。冰上静置30 min后,4七、12 000 r/min离心15 min,离心后取上清液即为肝组织 总蛋白。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒对各组肝 组织蛋白样品进行BCA定量分析后，加入1/4体积 的5 X上样缓冲液煮沸5 min使蛋白变性。行SDS-P AGE 凝胶电泳进行蛋白分离;220 mA、60 min的条 件下转至P VDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭P VDF膜1 h；抗 An t i-Wn t 2(1:1 000)、An t i-GAP DH(1:10 00
15、0)4弋孵育过夜,TBST漂洗3次；二抗(1:10 000)室温孵育1 h,TBST漂洗3次。使用ECL试剂 盒显影成像，使用Ima g e J软件测量Wn t 2和GAP DH 灰度值，并用Wn t 2/GAP DH进行半定量分析。1.3统计学处理 采用SP SS 25.0软件进行统计 学分析，作图软件为Gr a ph P a d P r ism&0。计量资料 以s表示,多组间比较采用方差分析，两组间比 较采用t检验。P 0.05示差异有统计学意义。2 结果2.1 PHx后肝质量变化的时间动力学特征 为了 观察P Hx后不同时间点小鼠肝质量变化的特征，分 别于P Hx后1、2、4、6、8 d
16、称取小鼠体质量和肝质 量。与Sh a m组比较，术后第1天肝体积最小，第2 天体积开始变大，到术后第6天达到高峰(图1)。肝切后第1天肝质量、肝质量/体质量最低(P 0.000 1),第6天就恢复到接近Sh a m组水平(表 1)O经统计学分析，各组肝质量和肝质量/体质量 结果差异有统计学意义(肝质量:F=26.317,P 0.000 1；肝质量/体质量:F=47.527,P 0.000 1)0 结果表明，小鼠P Hx后肝脏具有强大的再生修复能 力，能快速使肝质量恢复至相对正常水平。2.2 PHx后肝功能变化的时间动力学特征 为了 观察P Hx后肝脏质量变化过程中肝脏功能变化的 特征，于P Hx后1、2、4、6、8d收集血浆，用ALT、AST 试剂盒检测血浆中肝脏功能指标ALT和AST的水 平。结果显示肝切后ALT,AST水平均于第1天显 著升高(ALT：P 0.01；AST：P 40 30 BQ图1 PHx后各组肝组织形态变化1 Sb|；l j!|ih|：J;：!；J|bl；1 1W 40 50 60 巾 40 50H I60 40 SO术后表1 PHx后肝质量变化的时间动力学特征G
