1、772安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 14：11：11 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1339.012.h t ml从阿片受体在大鼠结肠平滑肌细胞中的表达任晓淳，贾冰涵I,李金钊I,罗慧娟I,李 愛，李军平I摘要 目的 通过培养大鼠结肠原代平滑肌细胞，探索 阿片受体（MOR）在结肠平滑肌细胞中的表达特性。方法 分离、培养和鉴定结肠平滑肌细胞;运用免疫荧光组织
2、化学 双重标记法观察MOR、内吗啡肽2（EM2）、钙调蛋白（Ca M）在结肠平滑肌细胞的分布特性;施加乙酰胆碱（ACh）（l x 10_3 mo l/L）或 EM2（2|j,mo l/L）后，West er n bl o t 技术检测 Ca M蛋白表达变化;单独或依次施加ACh（l X 10 3 mo l/L）和EM2（2|x mo l/L）后,钙离子成像法观察平滑肌细胞内钙 离子浓度的变化。结果 鉴定结肠平滑肌细胞:a-肌动蛋白（a-SMA）标记的阳性细胞占细胞总数的95%以上;免疫荧 光组织化学双重标记显示，在结肠平滑肌细胞有M0R和 EM2的分布，且所有MOR和EM2阳性细胞均与a-SM
3、A有 共存;West er n bl o t检测发现，施加ACh 10 min后,Ca M表达 升高（P 0.05）；施加EM2 10 min后，Ca M表达降低（P 0.05）;钙离子成像结果显示，单独施加ACh,平滑肌细胞内 钙离子浓度明显升高（P 0.05）;单独施加EM2,结肠平滑 肌细胞内钙离子浓度下调（P 0.05），依次施加ACh和EM2 后,EM2显著抑制了 ACh诱发的钙离子浓度升高（P 105个/ml密度接种于24孔细胞培养板，待细胞长到致密 单层后进行HE染色。弃掉原培养基，用P BS（4 弋）洗3次，每次5 mino加4%多聚甲醛500 室 温下固定30 min后，移出
4、细胞间，用P BS（4七）洗3 次。加入不同浓度梯度乙醇，无水乙醇I 5 min,无 水乙醇 U 5 min,95%乙醇 5 min,90%乙醇 5 min,80%乙醇5 min,70%乙醇5 min,流水冲洗2 min0 苏木精染色5 min,在流水下冲洗5 min,转移到盐酸 乙醇中分化3 s,继续流水冲洗15 min,用伊红染色5 mino脱水：70%乙醇3 s,80%乙醇3 s,90%乙醇3 s,95%乙醇5 min,无水100%乙醇I 5 min,无水 100%乙醇U 5 mino透明:分别加入1 ml二甲苯I 和二甲苯U各5 min,用中性树脂封片后在普通光镜 下观察。1.2.3免
5、疫荧光组织化学双重标记取第2次传 代细胞，按照1 x 105个/ml密度接种于24孔细胞培 养板,细胞在载玻片上生长融合到95%以上进行实 验。弃掉原培养基，用P BS（4咒）洗3次，每孔加入 500|114%多聚甲醛，室温下固定30 min0用P BS（4 玄）洗3次,每个孔内加入100 pil 0.5%Tr it o n X-100 孵育10 min,P BS洗3次，每次10 min。用5%羊血 清封闭30 min后,分别加入对应的一抗:兔抗M0R 多克隆抗体（1：200）和小鼠抗a-SMA单克隆抗体（1：200）、兔抗EM2多克隆抗体（1:100）和小鼠 抗a-SMA单克隆抗体（1:20
6、0）、兔抗Ca M单克隆 抗体（1：200）和豚鼠抗M0R多克隆抗体（1:200）,室温孵育1 h后，置于4咒孵育48 h0复 温20 min后，用P BS（4%）洗3次，每次10 min,分 别加入荧光素标记的二抗:Al ex 594标记山羊抗兔 血清（1:200）和Al ex 488标记山羊抗鼠血清（1:200）、Al ex 594标记山羊抗豚鼠血清（1:200）和Al ex 488标记山羊抗兔血清（1:200）o室温孵育 1 h后，用P BS（4七）洗3次，每次10 min,用DAP I 染核封片,5 min后用荧光显微镜观察并采集图片。1.2.4 West er n bl o t检测
7、取第2次传代的大鼠结 肠平滑肌细胞，弃掉培养基，用P BS清洗细胞3次,774安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)施加干预措施,将结肠平滑肌细胞分为三组,正常对 照组(CON)、乙酰胆碱组(ACh,浓度1 x 10 7 mo l/L)、内吗啡肽-2组(EM2,浓度2|imo l/L)，分别孵育 结肠平滑肌细胞1、5、10、15 min后提取蛋白。按 Ly sis bu f f er 1 ml,磷酸酶抑制剂10丛1,蛋白酶抑制 剂1|x l,P MSF 5讪配置细胞裂解液,摇匀置于冰面 上，用无菌细胞刮将细胞推
8、向培养瓶的一侧，于冰上 裂解30 min。不断摇晃培养瓶使细胞充分裂解，将 细胞碎片和裂解液移置1.5 ml离心管内，于4兀下 12 000 r/min离心5 min0将离心后的上清转移到 0.5 ml离心管中于一 80弋保存。用二座咻甲酸(BCA)法测量蛋白质浓度,分别取样品蛋白、纯水 和5 X蛋白上样缓冲液(5 X l o a d in g bu f f er)配平,分 装保存于-80 V，避免反复冻融。各样品蛋白取30 jig上样,80 V电压电泳30 min后,切换至120 V电 压继续进行，200 mA恒流湿转，MOR蛋白(60 min)、EM2 蛋白(20 min)、Ca M(30
9、 min)、GAP DH(40 min)分别转印到P VDF膜上。5%的脱脂牛奶 室温封闭2 h后,将含有EM2蛋白、MOR蛋白、Ca M 蛋白、GAP DH蛋白的P VDF膜浸入到对应的兔抗 EM2单克隆抗体(1:1 000)、兔抗MOR多克隆抗 体(1：1 000)、兔抗Ca M单克隆抗体(1:1 000)和 小鼠抗GAP DH单克隆抗体(1：2 000)，室温孵育1 h后置于4七过夜。用含0.1%吐温20的Tr is缓冲 盐溶液(t r is bu f f er ed sa l in e w it h t w een 20,TBST)洗膜 3次，每次10 mino加对应的HRP-山羊抗兔
10、Ig G(1:3 000)和 HRP-山羊抗小鼠 Ig G(l:3 000)室 温孵育1 h,TBST洗膜3次，每次10 min,超灵敏化 学发光试剂使蛋白条带可视化，通过化学图像系统(Amer sh a m Ia mg e 600)曝光采集图像。1.2.5钙离子成像检测 取第2次传代的大鼠结 肠平滑肌细胞，弃去培养液，用HBSS液(不含钙镁,不含酚红)冲洗细胞3次，加入钙离子荧光探针 Fl u o 4,AM 1|x l,pl u r o n ic F-127 1 pl,在 37 七的培 养箱中孵育30 min后,在荧光显微镜下观察负载情 况。将孵育的细胞置于显微镜下，打开加药通道，第 一通道
11、加入5 ml ACh(l X 10-3mo l/L)，第二通道加 入5 ml EM2(2 jimo l/L)，第三通道先加入5 ml ACh(1 x 10 7mo l/L)观察 200 s 后接着加入 5 ml EM2(2 p-mo l/L),打开氮气阀门，排空管内空气，选择中等 密度的细胞层，在激光显微镜下进行持续动态扫描,钙离子与Fl u o A,AM结合在488 n m的波长和526 n m的发射波长处被激发，通过计算机记录钙离子荧 光强度的变化。实验结果以给药前后单个细胞的荧 光强度变化表示细胞内游离钙离子浓度的相对变 化，实验结果用厶F/F。表示，F=F-F,F：钙离子 荧光强度值;
12、F。：基线水平。1.3统计学处理 采用SP SS 22.0软件进行数据 分析,West er n bl o t实验结果使用单因素方差分析,钙成像结果使用配对样本t检验,P 0.05)o 施加 ACh(l x l O-3 mo l/L)或 EM2(2 jjimo l/L)10 min时，与CON组比较,ACh组Ca M蛋白表达 升高(P=0.037 2),但EM2组Ca M蛋白表达下降(P=0.018 4),见图 7。2.7施加不同干预措施后，平滑肌细胞内钙离子浓 度的变化 施加ACh(l Xl O3 mo l/L),与给药前(Ba s e)比较,400 s后平滑肌细胞内钙离子荧光强度 增强(t
13、=3.101,P=0.021 1),700 s时达到高峰(图 8A、B)。施加 EM2(2 pu mo l/L)后，与给药前(Ba se)比较,400 s后平滑肌细胞内钙离子荧光强度降低Q=2.187,P=0.030 5,图 8C、D)。施加 ACh(l x 10 mo l/L)后，与给药前(Ba s e)比较，平滑肌细胞 内钙离子荧光强度增强(P=0.028 6),观察200 s 后接着施加EM2(2 jx mo l/L)，与单纯施加ACh(l x IO mo l/L)比较，平滑肌细胞内钙离子荧光强度下 降(F=24.20,P=0.000 2,图 8E、F)。3讨论原代结肠平滑肌细胞是从大鼠
14、远端结肠组织提 取和分离后获得的，遗传特征与体内细胞非常相似,适合于细胞形态、功能和分化方面的研究，排除了机 776 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)ABDE 亠%*、t?*GH.图3大鼠结肠平滑肌细胞HE染色A C：培养24 h的结肠平滑肌细胞；D F：培养7 d的结肠平滑肌细胞;GI：培养14 d的结肠平滑肌细胞；A、D、G：x 4；B、E、H：x l O；C、F、I：x 20图4免疫荧光组织化学双重标记x 20A:MOR阳性标记的平滑肌细胞;B:a-SMA阳性标记的平滑肌细胞;C：DAP I标记的细
15、胞核;D：MOR和a-SMA阳性标记物在平滑肌细胞中 的共表达;E：EM2阳性标记的平滑肌细胞;F：a-SMA阳性标记的平滑肌细胞;G：DAP I标记的细胞核;H：EM2和a-SMA阳性标记物在平滑肌 细胞中的共表达;箭头代表免疫荧光标记的阳性细胞A:MOR阳性标记物在结肠平滑肌细胞中的表达;B：Ca M阳性标记物在结肠平滑肌细胞中的表达;C：DAP I标记的细胞核;D：MOR和Ca M 阳性标记物在平滑肌细胞中的共表达;箭头代表免疫荧光标记的阳性细胞安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)777Ak u737k
16、 u5537图6 6 Western blot技术检测EM2和MOR在结肠平滑肌细胞的表达A:EM2在结肠平滑肌细胞中的蛋白表达;B：M0R在结肠平滑 肌细胞中的蛋白表达体内其他因素的干扰。a.SMA存在于胃肠道肌 层等各种肌组织内，构成了平滑肌细胞的骨架，参与 平滑肌细胞许多重要的功能活动,包括平滑肌细胞 的舒缩活动。因此,本研究通过标记a-SMA用于 鉴定结肠平滑肌细胞是可行的。课题组前期研究发现,EM2在结肠神经细胞 也有大量分布。然而,M0R和EM2在结肠平滑肌 细胞的分布未见文献报道。本研究免疫荧光组织化 学结果显示，在原代培养的平滑肌细胞内有M0R 和EM2的分布，且M0R与Ca M在培养的平滑肌细 胞内也有共存。Ca M是平滑肌细胞内的钙离子受体蛋白，其本 身没有活性,但对钙离子有高度依赖性。钙离子与 Ca M结合形成Ca2+-Ca M复合物,Ca2+-Ca M复合物 是一种重要的兴奋-收缩耦合调节因子问，通过平 滑肌细胞内信号传导通路,调控平滑肌收缩和舒 张M,当胞内钙离子浓度升高时，钙离子与Ca M形 成的Ca2+-Ca M复合物作用于胞质中的肌球蛋白轻 链激酶,使肌
