1、安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)819网络出版时间：2023-04-23 09：18：30 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.r.20230420.1340.019.h t mlJAK抑制剂托法替布治疗类风湿关节炎 相关间质性肺病的实验研究蒋 总打姚晓玲打唐 芳駕马武开駕兰维娅彳，姚血明彳,安 阳彳，刘正奇$摘要目的观察托法替布通过调控JAK-STAT信号通路 对间质性肺病(ILD)的影响。方法 Wist a r大鼠随
2、机分为正 常组、ILD模型组、醋酸泼尼松组、托法替布组。除正常组 外，其余3组予3 mg/ml博莱霉素溶液进行造模。灌胃干预 28 d后收集所有大鼠肺组织行HE染色West er n bl o t法检测 JAK1.STAT1蛋白含量;ELISA检测大鼠血清中肿瘤坏死因 子(TNF)-a、白细胞介素(IL)-6、IL-10、IL-l|3水平。结果 ILD模型组、醋酸泼尼松组、托法替布组肺组织HE染色均可 见肺泡组织增厚,肺泡壁毛细血管充血、支气管管腔上皮细 胞脱落、炎性细胞渗出。West er n bl o t结果显示ILD模型组 JAK1和STAT1均升高;与ILD模型组比较，托法替布组、醋
3、酸泼尼松组均有不同程度下降(P 0.05)。EUSA结果显示 ILD模型组血清TNF-a、IL-6、IL-10表达较正常组升高(P 0.01)；与ILD模型组比较，托法替布组、醋酸泼尼松组表达2022-12-23 接收基金项目：国家自然科学基金(编号：82160917);贵州省高层次创新 型人才培养计划(编号:黔科合平台人20165650)；贵州 省中医风湿免疫疾病临床研究中心项目(编号:黔科合平 台人才20202202号)；贵州省普通高等学校青年科技人 才成长项目(编号:黔教合KY字2022262号)；贵州省 卫健委科技基金(编号:g zw k j2021-142)作者单位J贵州中医药大学第
4、二临床医学院，贵阳5500022贵州中医药大学第二附属医院风湿免疫科，贵阳550003作者简介:蒋总，男，住院医师；唐 芳，女，主任医师，博士生导师，责任作者,E-ma il：64550932 q q.c o m 均下降(P 0.05),IL-10表达与之相反。结论托法替布 通过抑制JAK-STAT通路并下调炎症因子TNF-a JL-6JL-及上调抑炎因子IL-10的表达，减轻肺组织损伤,减轻炎 症反应，治疗ILD。关键词JAK-STAT；托法替布;类风湿关节炎;间质性肺病 中图分类号R 593.2 文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0819-05 d o i：10.1
5、9405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.019类风湿关节炎(r h eu ma t o id a r t h r it is,RA)是一种 多器官、多系统受累的免疫性疾病。普通型间质 性肺炎(u su a l in t er st it ia l pn eu mo n ia,UIP)是 RA间质 性肺病(in t er st it ia l l u n g d isea se,ILD)中最常见的类 型之一，也是RA死亡的主要原因之一。目前 RA-ILD的发病机制尚不清楚，且缺乏有效的治疗手 段。因此，探索RA-ILD的发病机制及寻求有效治 疗药物尤为重要。
6、目前研究证实JAK信号通路与 RA密切相关，相关药物已经批准用于临床。临 床中也发现托法替布(JAK抑制剂)不仅能有效缓 解RA病情，还能缓解ILD影像学表现。已有研 究报道发现ILD与JAK信号通路有明显的相关 性,但无明确的证据显示JAK信号通路与RA-ILD 发病的关系。该研究通过建立RA-ILD动物模型，研究托法替布抑制JAK信号通路治疗RA-ILD的分 子机制，为临床治疗RA-ILD提供新的方法。o f HGFs w a s sig n if ic a n t l y impr o v ed a t t h e c o n c en t r a t io n s o f 12.5,2
7、5,50 a n d 100 mg/L GsRg l(P 0 05),a n d t h e pr o l if er a t io n pr o mo t io n ef f ec t o f 100 mg/L GsRg l w a s t h e st r o n g est.Th er e w a s n o sig n if ic a n t d if f er en c e bet w een t h e 6.25 mg/L GsRg l g r o u p a n d t h e c o n t r o l g r o u p.Af t er GsRg l t r ea t men
8、 t,t h e mig r a t io n a bil it y o f HGFs w a s en h a n c ed a n d sh o w ed c o n c en t r a t io n d epen d en c e.Co mpa r ed w it h t h e c o n t r o l g r o u p,t h e a c t iv it y o f ALP in 100 mg/L GsRg l g r o u p sig n if ic a n d y in c r ea sed(P 0.01).Al iza r in r ed st a in in g sh
9、 o w ed a sig n if ic a n t in c r ea se in t h e n u mber o f c a l c iu m n o d u l es(P 0.01).Th e mRNA a n d eg g w h it e ex pr essio n l ev el s o f o st eo g en ic g en es OCN,OP N a n d COL-I inc r ea sed(P 0.05).Th e ex pr essio n l ev el s o f p-P I3K a n d p-Ak t w er e sig n if ic a n t
10、l y u p-r eg u l a t ed w it h t ime(P 6、IL-10表达按照试剂盒说明书:设置标准品孔和样 本孔，加入不同浓度的标准品50讪(样本孔先加待 测样本10|x l和释品40 jil)，每孔加入检测抗体100 以,用封板膜封住孔板,37戏放置60 min弃去板孔 中液体加满洗涤液,静置后弃去洗涤液，重复5次,每孔加入底物A、B各50|x l,37咒避光孵育15 min 后，每孔加入终止液50,在450 n m波长处测定各 孔的吸光度(o pt ic a l d en sit y,0D)值。1.3.4 West er n bl o t 法检测肺组织中 JAK1、
11、STAT1 蛋白表达将组织放在研钵中，加入适量液氮冷冻 组织后研磨组织成粉末，加入RIP A裂解液充分裂 解细胞并提取上清，制胶，放入电泳槽。分别从各样 本总蛋白中取出500(jig与5 x SDS上样缓冲液按4:1比例混合,混合后蛋白的浓度为3.3 pLg/|x l,金属 浴加热100咒6 min使蛋白变性后上样进行电泳,电泳完毕后取出膜并做好正反面标记，在TBST中 清洗1 min,然后用5%脱脂牛奶封闭液室温封闭1 h后用TBST洗3次，用一抗稀释液按1：1 000稀释 一抗,4咒孵育过夜,用封闭液将二抗稀释成一定的 浓度(1:2 000),然后室温孵育1 h,TBST清洗3 次，将曝光
12、液均匀覆盖在整片膜上反应后放入曝光 仪曝光检测。1.4统计学处理 采用SP SS 25.0统计软件进行 数据分析，图片使用Gr a ph P a d 9.4.1软件制作。计 量资料符合正态分布及方差齐性采用单因素方差分 析,非正态或方差不齐采用秩和检验,P 0.05为差 异有统计学意义。2 结果2.1各组大鼠一般情况 正常组自实验开始至结 束精神状态可，皮毛光泽,反应灵活，饮食、饮水量、呼吸频率均正常,体质量自然增长；ILD模型组造模 1 d后出现活动减少，毛色欠光泽、蜷缩，呼吸加快,耸毛、饮食和饮水减少,体质量减轻,实验后期体质 量缓慢增长，饮食、饮水较少;醋酸泼尼松组造模后 逐渐出现活动减
13、少,毛色欠光泽,轻度耸毛、蜷缩、饮 食减少，灌胃干预后体质量逐渐缓慢增长,呼吸频率 逐渐缓慢至正常;托法替布组造模1 d后逐渐出现 活动减少,毛色欠光泽,耸毛、蜷缩、饮食减少，灌胃 干预后饮食逐渐恢复,体质量增长速度缓慢。2.2 HE染色 正常组肺泡结构清晰，肺泡壁结构 完整正常。ILD模型组肺组织对比正常组趋向实 化,大多数肺泡壁毛细血管充血,肺泡壁增宽增厚;血管及支气管周围淋巴细胞浸润,肺泡腔内有炎性 渗出物;支气管管腔内有大量脱落的上皮细胞及炎 症细胞;可见少量心衰细胞。与ILD模型组比较，醋 酸泼尼松组肺泡壁增厚现象减轻,肺组织实化有所 改善,但仍可见大量肺泡壁毛细血管充血、支气管管
14、腔上皮细胞脱落及少量炎症细胞浸润。与ILD模型 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)821组比较,托法替布组肺泡壁增厚现象减轻,肺泡组织 结构较为清晰，趋向正常组;少量肺泡壁毛细血管充 血，支气管管腔内可见少量脱落的上皮细胞及炎症 细胞,偶见炎性渗出物分布于肺泡腔内。见图1。图1各组大鼠肺组织病理切片A：正常组；B：ILD模型组;C：醋酸泼尼松组;D：托法替布组2.3 Western blot法检测肺组织中JAK1和 STAT1的蛋白表达ILD模型组中JAK1和STAT1 的总蛋白水平高于正常组(P 0.01
15、),经药物干预 治疗后JAK1和STAT1的总蛋白水平低于ILD模型 组(P 0.05),STATl在醋酸泼尼松组与托法替布组比较 差异有统计学意义(P 0.05)o见图2。2.4 ELISA 测定大鼠血清中 TNF-a、IL、IL-10、IL-1卩含量与正常组、醋酸泼尼松组、托法替布组 比较,ILD模型组中TNF-a JL-6JL-1|3浓度增高(P 0.01),IL-10浓度降低(P 0.01)；与醋酸泼尼松 组比较，托法替布组TNF-a.IL-6JL-1P浓度增高(P 0.05),IL-10浓度降低(P 0.01)。以上结果表 明托法替布可有效降低ILD血清水平TNF-a JL-6,IL
16、-ip及上调抑炎因子IL-10的表达发挥抗炎作用。见图3。A a b c d k uJAK1 133故蛊wgIFSTAT1 91MwmwgUVHS图2各组肺组织中JAK1和STAT1的蛋白表达A洛指标条带图；B：JAK1、STAT1的蛋白表达量正常组;b：ILD模型组；c：醋酸泼尼松组;d:托法替布组;与正常组比较:*P 0.01；与ILD模型组比较严P 0.01；与醋酸泼尼松组比较:0.053讨论RA发病过程中的关键细胞因子包括干扰素(in t er f er o n s,INF)-o/卩、IL-1,IL-6,IL-10 和 TNF 等。正常情况下，这些被分泌至胞外的细胞因子 或促进炎症或抑制炎症,相互调节,最终维持机体的 免疫稳态。然而，在RA患者体内的促炎/抑炎因子 稳态被打破，最终导致疾病的发展O822安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)o o oo o o5 0 55 0 511 1111 11A(lul/ssgm50501111505000001111#A#A#A#Ada#AA*Tbo o
