1、742安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 11：34：20 网络出版地址:h t t ps：/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1339.008.h t ml扁桃酸对肺腺癌H1299细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响及其机制陆海青打李艳丽駕华兹涵打肖佳欣駕凌 博打叶广彬彳摘要 目的 探索扁桃酸对肺腺癌H1299细胞增殖、凋亡 和迁移的作用及相关的分子机制。方法 CCK-8检测 H1299细胞增殖能力变化
2、；Ho ec h st 33258/P I双染分析 H1299细胞凋亡水平;划痕和Tr a n sw e U实验分析H1299细 胞侵袭迁移能力变化;West er n bl o t检测细胞增殖、凋亡和迁 移相关通路蛋白的表达。结果不同浓度扁桃酸均可抑制 H1299细胞增殖活力和侵袭迁移能力（P 0.05）o扁桃酸 可诱导细胞增殖、凋亡通路蛋白ba x、c l-c a spa se-3高表达,p-st a t 3低表达（P 0.05）o此外，抑制侵袭迁移相关蛋白 MMP-9和Vimen t i n蛋白表达（P 0.01）o结论 扁桃酸抑 制肺腺癌细胞H1299的增殖，提升细胞凋亡水平，其分子生
3、 物学机制可能与st a t 3活化降低及激活ba x/c a spa se-3信号轴 密切相关;抑制H1299细胞侵袭迁移能力，与MMP-9和Vi-men t in蛋白表达降低相关。关键词肺腺癌;扁桃酸;增殖;凋亡;迁移中图分类号R932文献标志码A 文章编号1000-1492（2023）05-0742-06 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.007中医药防治肺癌广泛应用于临床，且在疗效和 预后中具有其独特的优势1-2o以苦杏仁为核心组 方药物的薯議丸、清气化痰丸和益肺清化膏，均可明 显改善肺癌患者的临床疗效，尤其在增强患者放化
4、 疗的疗效、缓解咳喘等临床症状和提升生活质量方 面优势明显3-40研究A7表明，苦杏仁昔是苦杏 仁抗肿瘤的核心有效成分,苦杏仁昔抗肿瘤的部分 作用是由其催化产物所实现的，如肿瘤细胞无法代 谢氢氤酸（苦杏仁昔催化产物），故诱导肿瘤细胞凋2022-12-20 接收基金项目：国家自然科学基金（编号=82060540）;广西高校中青年教 师基础能力提升项目（编号：2022KY0541、2022KY0533）；广西壮族自治区级大学生创新创业训练计划项目（编号:S202210599069、S202110599069,S202110599095）作者单位:右江民族医学院1药学院、2基础医学院，百色53300
5、0 作者简介:陆海青，女,本科；叶广彬，男,实验师，责任作者,E-ma il：y g b9064 126.c o m；凌 博，男，教授，硕士生导师，责任作者,E-ma il:l in g bo 268 163.c o m 亡。但是，同为苦杏仁昔催化产物的扁桃酸，在肺腺 癌中的作用及机制尚不清楚。该研究以不同浓度扁 桃酸干预肺腺癌H1299细胞，分析肺腺癌细胞增 殖、凋亡和迁移能力的变化，聚焦相关通路蛋白的检 测，从而整体分析扁桃酸抗肺腺癌细胞的作用和机 制,继而为苦杏仁及苦杏仁昔对肿瘤治疗的临床应 用提供实验依据。1材料与方法1.1实验材料 人肺腺癌H1299细胞购于中国科 学院细胞库。基础培
6、养基DMEM、10%胎牛血清（美国Gibc o公司）制备完全培养基,0.25%胰蛋白 酶（美国Gibc o公司）用于细胞消化。扁桃酸购于美 国Sig ma公司，用DMSO溶解，制备成母液（500|x g/ml），进行滤膜过滤除菌除杂质，再用培养基稀释成 不同浓度备用。CCK-8试剂购于中国Bio sh a r p公 司；Ho ec h st 33258和P I试剂购于北京索莱宝科技有 限公司;Ma t r ig el基质胶和Tr a n sw el l小室购于美国 BD公司；West er n bl o t实验基础试剂:SDS-P AGE凝 胶试剂盒、BCA检测试剂盒和ECL超敏显影试剂盒 购
7、于上海碧云天生物技术有限公司；st a t 3、p-st a t 3、ba x、bc l2、c a spa se-3 A c l-c a spa se-3 MMP9、Vimen t in 和p-t u bu l in单克隆抗体均购于艾博抗（上海）贸易 有限公司。1.2方法1.2.1 CCK-8检测 取对数期生长的H1299细胞 制成细胞悬液，计数并接种于96孔板，每孔接种 100叭6 x 104个/孔），设置6个复孔。待细胞长满 后，更换含不同浓度扁桃酸（0、5、7.5、10和20|jLg/ml）的完全培养基，分别培养24 h和48 h。弃培养 基，再分别滴加CCK-8溶液（10 pV孔），培
8、养箱中 孵育4 h后，用酶标仪在450 n m波长下检测各孔的 吸光度值,计算细胞增殖抑制率并绘制曲线。1.2.2 Ho ec h st 33258/P I双染 取对数期生长的 H1299细胞制成细胞悬液，调整细胞密度并接种到 6孔板中（2 x IO个/孔）培养。实验组给予10 p,g/ml和20|x g/ml扁桃酸，对照组给予0|x g/ml扁桃酸 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)743干预24h。收集细胞，加入4%多聚甲醛固定4弋 10 min,l 000 r/min离心3 min弃上清液，加入1 m
9、l 预冷P BS重悬细胞沉淀,1 000 r/min离心3 min弃 上清液，滴加100 pul Ho ec h st 33258和P I混合工作 液重悬细胞沉淀,室温避光染色10 min,加入1 ml 预冷P BS洗涤,1 000 r/min离心3 min弃上清液，残 留上清液50 pl重悬细胞，加入10 pil抗荧光淬灭 剂。取10 pl细胞悬液滴至载玻片，置于倒置荧光 显微镜下拍照。凋亡细胞的判定标准为细胞呈高蓝 光低红光。1.2.3划痕实验 取对数期生长的H1299细胞制 成细胞悬液，调整细胞密度并接种到6孔板中（2 x 105个/孔）培养。待细胞长满后，用10讪枪头在孔 内竖线划痕，
10、并添加含不同浓度扁桃酸（0、5、7.5和 10 jjig/ml）的无血清培养基进行干预。培养24 h 后，用显微镜进行观察孔内细胞的愈合情况，拍照。1.2.4 Tr a n sw el l迁移实验 将孔径0.8|im小室 放入24孔板中,0.25%胰酶消化处理后的H1299 细胞，离心去上清液,P BS洗涤2遍,用无血清培养 基重悬细胞，计数并调整细胞密度为2 x IO个/ml。取100（jl1细胞悬液加入小室,同时在Tr a n sw el l下室 分别加入600 pl含不同浓度扁桃酸（0、5、7.5和10 pg/ml）的完全培养基，培养24 h后，用4%多聚甲 醛固定和1%结晶紫染色,P
11、BS洗涤3次，棉签轻轻 擦去上层未迁移的细胞，显微镜下随机选取3个视 野，利用Ima g e J进行细胞计数。1.2.5 Tr a n sw el l侵袭实验 0.25%胰酶消化对数 生长期H1299细胞，用无血清培养基重悬细胞，调 整细胞密度至2 X IO个/ml。Tr a n sw el l下室分别加 A600 111含不同浓度扁桃酸（0、5、7.5和10 Jig/ml）的完全培养基，上室先铺水化的BD胶基底膜,再加100|x l细胞悬液。培养24 h后，用4%多聚甲 醛固定和1%结晶紫染色,P BS洗涤3次，棉签轻轻 擦去上层未迁移的细胞，显微镜下随机选取3个视 野，利用Ima g e
12、J进行细胞计数。1.2.6 West er n bl o t检测 不同浓度扁桃酸（0、5、10和20|x g/ml）干预H1299细胞后，取细胞总蛋白 进行SDS-P AGE电泳,转膜。P VDF膜用5%脱脂奶 粉封闭2 h,TBST洗涤3遍，添加一抗（一抗稀释液 1：2 000稀释）后4咒静置过夜。TBST洗涤3遍,二抗（5%脱脂奶粉1:1 000稀释）室温孵育2 h。取出P VDF膜滴加ECL显影液，在凝胶成像系统下 显影成像，用Ima g e J分析蛋白条带灰度值。1.3 统计学处理 实验数据采用SP SS 23.0和 Gr a ph pa d P r ism 5.0软件进行统计学分析和
13、作图。计量数据采用力土 S表示，符合正态分布和方差齐性 的多组间比较采用单因素方差分析（o n e w a y ANO-VA），两两比较采用LSD-t检验。P0.05为差异 有统计学意义。2 结果2.1扁桃酸抑制肺腺癌H1299细胞增殖 为研究 不同浓度扁桃酸对肺腺癌细胞H1299增殖的影响,用不同浓度扁桃酸分别作用于H1299细胞24 h和 48 h,从而确定扁桃酸的时效和量效。结果表明，不 同浓度扁桃酸对H1299细胞的增殖活力均有抑制 作用（24 h：F=51.6,P 0.001；48 h：F=253.7,P 0.001）,提示扁桃酸可以抑制肺腺癌H1299细胞 增殖（图1）。A*5 7
14、.5 10扁桃酸浓度g/ml)200150500100*-I-*5 7.5 10 20扁桃酸浓度g/ml)图1扁桃酸对H1299细胞增殖能力的影响A：24 h；B：48 h；与0 ix g/ml 比较：*P 0.0012.2扁桃酸诱导肺腺癌H1299细胞凋亡 采用 Ho ec h st 33258联合P I双染可以较好区分活细胞和 细胞的凋亡、坏死。结果表明,不同浓度扁桃酸处理 肺腺癌H1299细胞24 h后，实验组（10|ig/ml和20 Mg/ml）细胞凋亡（细胞呈高蓝光低红光）数量均明 显高于对照组（0 l ig/ml）,提示扁桃酸可诱导肺腺 744安徽医科大学学报 Acta Unive
15、rsitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)癌H1299细胞凋亡(图2)。2.3扁桃酸降低肺腺癌H1299细胞的侵袭迁移 划痕实验结果显示,不同浓度扁桃酸处理H1299细 胞24 h后，实验组的细胞迁移率均明显低于对照组(F=332.7,P 0.001)。Tr a n sw eU 迁移实验结果显 示,不同浓度扁桃酸处理H1299细胞24 h后，实验 组的细胞迁移数5 Mg/ml:(1 552.33 4&13)个/视野；7.5 Mg/ml：(611.67 124.71)个/视野；10 ix g/ml：(266.33 23.07)个/视野均明显低于对照 组的
16、细胞迁移数0 044.67 41.86)个/视野,差异有统计学意义(F=532.6,P 0.001)。以上结果提示扁桃酸可以抑制肺腺癌H1299细胞 迁移。见图3。Tr a n sw eU侵袭实验结果显示，不同浓度扁桃酸处理H1299细胞24 h后,实验组的细胞穿透数5|ig/ml:(464.00 69.42)个/视野；7.5|ig/ml:(65.67 26.31)个/视野；10|ig/ml：(28.00 14.73)个/视野均明显低于对照组的细胞穿透数 0|ig/ml：(657.67 101.12)个/视野，差异有统 计学意义(F=65.94,P 0.001),这提示扁桃酸可 以抑制肺腺癌H1299细胞侵袭。见图3。|x g/ml)比较,实验组(5、10和20|x g/ml)中的细胞 凋亡相关蛋白c l-c a spa se-3/c a s pa se-3明显表达上升(F=1816,P 0.001),bc l-2/ba x 明显表达降低(F=1855,P 0.001)；而细胞侵袭迁移相关蛋白 MMP-9(F=336.2,P 0.001)和 Vimen t in(F=35&9,P 0.
