1、北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.2129牙周炎是发生在牙周支持组织的感染性疾病，其始动因子是菌斑微生物及其产物。菌斑微生物包括龈上菌斑和龈下菌斑，其中龈下菌斑不易受唾液和咀嚼等影响。龈下微生物的检测方法很多，随着宏基因组技术的进步，越来越多的学者使用高通量测序技术从整体上分析细菌的组成和结构1,2。16SrRNA 测序技术是最常用的高通量测序依赖组学技术之一，通过生物信息学分析可以获得细菌组成、物种丰度、系统进化、群落比较等诸多信息。学者发现，居住于高原地区的人群慢性牙周炎的患病率和
2、严重程度明显高于平原地区，并随着居住地海拔的升高、居住时间的延长而显著升高，高原移居者牙周炎患病率也高于世居者3，缺氧会加重牙周炎4。本研究使用 16SrRNA 高通量测序的方法分析西藏藏族和汉族牙周炎患者龈下微生物群落结构差异，并初步探讨西藏的汉族牙周炎患者从高原地区返回平原地区后龈下微生物结构的变化，以初步探讨高原和民族因素对牙周炎患者龈下菌群的影响。资料和方法1.研究对象 病例选自西藏自治区人民政府驻成都办事处医院口腔科门诊慢性牙周炎患者共 39 例，均因工作或生活长期居住在西藏 10 年以上，藏族 20 例，汉族19例，男性26例，女性13例，年龄范围2381岁，平均年龄（4611.4
3、5）岁。慢性牙周炎的纳入标准：藏族和汉族牙周炎患者龈下微生物群落结构分析杜启莲 唐灿 袁星 李紫嫣【摘要】目的 比较西藏藏族和汉族牙周炎患者龈下微生物群落结构的差异，并初步探讨汉族牙周炎患者从高海拔地区到低海拔地区后龈下微生物群落结构的变化。方法 纳入长期在西藏的藏族牙周炎患者 20 例和汉族牙周炎 19 例，用 Illumina MiSeq 测序平台进行龈下菌斑的 16SrRNA 高通量测序，对比分析二者的微生物群落结构差异。选择 5 例西藏汉族牙周炎患者，对比其从西藏高海拔地区到成都平原地区后龈下微生物群落结构的变化。结果 西藏汉族牙周炎患者的龈下微生物物种丰富度及微生物多样性均比藏族略高
4、，西藏汉族牙周炎患者到达成都 2 个月后，相比刚到达 1 周时，物种丰度和微生物多样性增加，但均无统计学差异。西藏汉族牙周炎的产线菌属较藏族高，西藏汉族牙周炎患者到达成都平原后弯曲杆菌、艾肯氏菌显著增加。结论 民族与海拔因素可能对牙周炎患者的龈下微生物群落结构产生影响。【关键词】牙周炎；藏族；龈下微生物；16SrRNA；高原【中图号】R781.42【文献标识码】A 【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.02.012Comparative analysis of subgingival microbiome between Tibetan and Han p
5、eriodontitis patients DU Qi-lian，TANG Can，YUAN Xing，LI Zi-yan.Department of Stomatology,Hospital of Chengdu Office of Peoples Government of Tibetan Autonomous Region,Chengdu 610041,China【Abstract】Objective To compare the difference in the subgingival microbiome between Tibetan and Han periodontitis
6、patients in Tibet.Methods Twenty Tibetan periodontitis patients and 19 Han periodontitis patients were enrolled.The Illumina MiSeq sequencing platform was used to perform 16SrRNA high-throughput sequencing of subgingival plaque,and the difference in the microbial community structure of the two group
7、s was compared.Five Hans patients were selected to compare the changes in the subgingival microbial community structure.Results The subgingival microbial species richness and microbial diversity of the Han periodontitis patients was slightly higher than that of the Tibetans.Two months after the Tibe
8、tan Han periodontitis patients arrived in Chengdu,the species abundance and microbial diversity of the Tibetan Han periodontitis patients increased,but there was no statistical difference.Filifactor in Han patients was higher than that of the Tibetan.After the Han patients in Tibet returned to Cheng
9、du Plain,Campylobacter and Eikenella increased significantly.Conclusions Ethnic and altitude factors may have an impact on the subgingival microbial community structure in patients with periodontitis.【Key words】Periodontitis;Tibetans;Subgingival microorganisms;16SrRNA;Plateau基金项目：西藏自治区自然科学基金（XZ2018Z
10、RD-116）作者单位：610041 成都 西藏自治区人民政府驻成都办事处医院口腔科通信作者：杜启莲，E-mail：，电话：13308050596北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.2130探诊深度（probing depth，PD）4mm 或临床附着丧失（clinical attachment loss,CAL）2mm；X 线片示牙槽骨吸收超过根长 1/3；无糖尿病、甲亢、心血管等系统性疾病；无吸烟史；3 个月内未服用过抗生素，6 个月内未行牙周治疗。所有志愿者均签署知情同意书，本研究
11、获得医院伦理委员会批准(批号：2018 科研第 44 号)。2.样本采集 口腔内每个象限各选取探诊最深的 1 个位点作为样本采集牙位，棉卷隔湿，气枪吹干牙面，先刮尽龈上菌斑，使用龈下刮治器刮取牙周袋内菌斑，将其置于含 1 ml 灭菌生理盐水的冻存管中，在 2 h内送至-80 冰箱中存放。其中有 5 例长期在西藏的汉族牙周炎患者，行2 次样本采集，第一次采集时间点是对象从西藏高原返回成都平原的第 1 周之内，第二次采集时间点是对象返回成都平原达2个月后。两次采集的位点相同。3.DNA 抽提和 PCR 扩增根 据 E.Z.N.A.soil 试 剂 盒(Omega Bio-tek,Norcross,
12、GA,U.S.)说明书进行总 DNA 抽提，DNA浓 度 和 纯 度 利 用 NanoDrop2000 进 行 检 测，利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取质量；用338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)引物对 V3-V4 可变区进行 PCR 扩增。4.Illumina Miseq 测序使用 2%琼脂糖凝胶回收 PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2%琼 脂
13、 糖 电 泳 检 测。利 用 QuantiFluor-ST(Promega,USA)进 行 检 测 定 量。根 据 Illumina MiSeq 平台(Illumina,San Diego,USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建 PE 2300 的文库。构建文库步骤:连接“Y”字形接头；使磁珠筛选去除接头自连片段；利用 PCR 扩增进行文库模板的富集；氢氧化钠变性,产生单链 DNA 片段。利用 Illumina 公司的 Miseq PE300 平台进行测序。5.分析方法先根据原始序列的 barcodes 信息，运用 QIIME2 demux 插件对不同样本的序列进行拆分，将拆分后的序列，运
14、用 QIIME2 dada2 插件进行质控，修剪，去噪，拼接，去除嵌合体后，得到了最终的特征序列表格。运用 QIIME2 feature-classifier 插件将 ASV的代表序列比对到预先训练好的 GREENGENES 数据库得到物种的分类信息表。Alpha 多样性指数被用于评估样本本身的多样性程度。结 果1.西藏藏族与汉族牙周炎的物种组成分析 通过 Illumina MiSeq 测序平台对 20 例西藏藏族和 19 例汉族牙周炎患者龈下菌斑 16SrRNA 基因（V3-V4 区）生物多样性检测，共计获得藏族 1939个 OTU，汉族 2128 个 OTU，两组共有的 OTU 为1030
15、个，占48.4%53.1%。物种组成的Veen图见图1，汉族比藏族的物种组成略丰富，但二者差异不大。2.西藏汉族牙周炎到达成都 1 周内与 2 个月时龈下菌斑物种分析长期在西藏的 5 名汉族牙周炎患者从高原到平原 1 周内（A 组）和 2 个月后（B 组）样本的物种组成分析得出，A 组共计获得 757 个 OTU,B 组共计获得 867 个 OTU,两组共有的 OTU 为 520 个，占59.9%68.6%（图 2）。从图 2 可见，西藏汉族牙周炎患者从西藏高原到达成都平原后 2 个月比到达1 周时物种略丰富。3.西藏藏族与汉族牙周炎患者龈下微生物Alpha 多样性分析长期在西藏的藏族和汉族牙
16、周炎患者龈下菌斑微生物 Alpha 多样性 shannon 指数显示（P 0.05），两组间无明显差异，但总体趋势为汉族牙周炎患者较藏族牙周炎患者的微生物多样性稍高（图 3）。4.西藏汉族牙周炎到达成都 1 周内与 2 个月时龈下菌斑 Alpha 多样性分析长期在西藏的汉族牙周炎患者从西藏高原到达图 1 西藏藏族和汉族牙周炎患者龈下菌斑物种组成 Veen 图北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.2131成都平原 1 周时（A 组）和 2 个月时（B 组）龈下菌斑微生物 Alpha 多样性 shannon 指数显示，在平原2 个月时（B 组）较到达平原时（A 组）具有更高的微生物多样性（图 4），但无统计学差异（P 0.05）。5.西藏藏族和汉族牙周炎患者龈下菌斑微生物群落结构差异和优势群种分析LEfSe 多级物种差异判别分析长期在西藏的藏族和汉族牙周炎患者龈下菌斑微生物物种差异显示，藏族牙周炎患者龈下菌斑微生物中乳酸杆菌（Lactobacillales）、杆 菌（Bacilli）、
