1、收稿日期 修回日期 作者单位 湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院 脊柱外科，作者简介 刘文斌（），男，主治医师文章编号（）基础医学 靶向 轴促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究刘文斌，李艳兵，周焱涛摘要目的：探讨长链非编码（）人类白细胞抗原复合体（）对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及可能机制。方法：收集 例骨肉瘤组织及对应瘤旁组织，法检测组织中 和 表达，相关分析评价骨肉瘤组织中 和 表达的相关性。体外培养骨肉瘤 细胞，分别转染、共转染 与 或 与 后，采用 法和克隆形成实验检测细胞增殖，划痕实验和 分别检测细胞迁移和侵袭，蛋白印迹法检测细胞中 蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证 和
2、及 和 调控关系。结果：骨肉瘤组织中 表达量高于瘤旁组织（），而 表达量低于瘤旁组织（）。相关分析结果显示，骨肉瘤组织中 与 的表达呈负相关关系（，）。下调 或上调 后，细胞吸光度值和克隆形成数降低（），划痕愈合率和细胞侵袭数降低（）。靶向负调控，而 是 靶基因。下调 逆转下调 对骨肉瘤 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。上调 可逆转上调 对骨肉瘤 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论：在骨肉瘤组织中表达升高，其可能通过靶向 轴促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。关键词 骨肉瘤；人类白细胞抗原复合体；轴；细胞增殖；迁移；侵袭中图法分类号 文献标志码 ：，（，）：（）（），：，：，（），（）（，），（
3、），（），：，；蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 骨肉瘤是好发于儿童及青少年的骨组织恶性肿瘤，易复发和转移，预后较差。目前，骨肉瘤发病机制尚未明确。研究显示，骨肉瘤的发生发展与癌基因的异常激活及抑癌基因的失活有关，探究骨肉瘤中异常表达的基因分子，可为其治疗提供分子靶点。长链非编码 （）和微小（）是两类小分子非编码，且 可靶向 进而调控 靶基因的表达，参与肿瘤细胞增殖和凋亡等生命活动，为肿瘤的治疗提供了分子靶点。人类白细胞抗原复合体（，）属于一种，其在胃癌、肝癌、鼻咽癌和肺腺癌等肿瘤中表达升高，促进这些肿瘤的发展进程。靶基因软件预测显示，可能靶向结合，而叉头框蛋白（，）可能是 的靶基因。低表达
4、与骨肉瘤进展过程中的生理病理学活动密切相关，通过上调 可增强体外骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，延缓肿瘤进展。是叉头框家族成员之一，参与心肌细胞发育、免疫 细胞分化等过程。有报道称，在骨肉瘤组织中表达升高，促进骨肉瘤增殖和转移。本研究检测了骨肉瘤组织中 的表达，然后以骨肉瘤 细胞为研究对象，轴为切入点，探讨 对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。现作报道。资料与方法 一般资料 收集 年 月至 年 月在我院确诊并行手术治疗的骨肉瘤病人 例瘤组织及对应的瘤旁组织，液氮保存。其中女 例，男 例；年龄 岁，平均（）岁。排除标准：合并其他恶性肿瘤；合并心、肝、肾等重要脏器功能障碍。组织样本取材经病人
5、或家属同意，研究经本院伦理委员会批准。细胞和试剂 细胞株（中国科学院上海细胞库）；抽提试剂盒、逆转录试剂盒和 试剂盒（大连宝生物）；培养基、双荧光素酶活性检测试剂盒、二喹啉甲酸（）蛋白检测试剂盒（北京索莱宝）；胎牛血清（）（浙江天杭生物科技股份有限公司）；试剂盒（美国 公司）；引物、小干扰（）、乱序无意义阴性序列（）、抑制剂（）及抑制剂阴性序列（）、和 的野生型质粒（、）及突变型质粒（、）、模 拟 物（）、模拟对照序列（）、过表达载体（）、空载体（）（上海生工）；兔 抗 人 和 甘 油 醛磷 酸 脱 氢 酶（）单克隆抗体（美国 公司）。方法 法检测 和 表达 将收集的新鲜组织样本在液氮保护下进
6、行研磨，用 抽提试剂提取组织总。然后将 逆转录生成，并行 扩增。扩增程序：；，共 个循环。引物序列：上游 ，下游 ；上游 ，下游 ；上游 ，下游 ；上游 ，下游 。法计算 相对于内参、相对于内参 的表达水平。细胞培养和转染 将 细胞在超净工作台中复苏，加含 的 培养基，于 、体积分数、湿度 的培养箱中培养。取对数期 接种于 孔板中（个 孔），用 脂质体法，分别转染 （组）、（组）、（组）、（组）、共转染 与（组）、与（组）、与（组）、与 （组）。转染 后，更换为含 的 培养基，再培养，法检测细胞中 或 表达验证转染效果，方法同 ，并收集细胞备用。同时设置对照组（组），细胞用常规培养基培养，不进
7、行任何转染操作。法检测细胞增殖将各组细胞接种于 孔板中（个 孔），培养 后，加 试 剂。孵 育 ，用 酶 标 仪（，）测吸光度值。克隆形成实验将各组细胞接种于 孔板中（个 孔），每 换一次培养基。培养 后，弃培养基。用多聚甲醛固定、结晶紫染色后，显微镜观察，对超过 个细胞的克隆记数。划痕实验检测细胞迁移将各组细胞接种于 孔板中（个 孔），培养 后，弃培养基。用 移液器枪头在培养板底部平行于中轴线划两条平行线，并用 清洗掉划痕间细胞，测量划痕间距，记为。更换为新鲜培养基，培养 后，再次测量细胞间间距，记为。划痕愈合率（）（）。法检测细胞侵袭将 小室置于 孔板中，铺 基质胶，自然晾干。在上室中加含
8、 个细胞的细胞悬液，下室加 培养基。培养 后，随后弃培养基，用多聚甲醛固定、结晶紫染色。将基质胶下层置于倒置显微镜下观察。随机取 个视野，对视野下的细胞记数。免疫印迹法检测 蛋白表达 将各组细胞接种于 孔板中（个 孔），培养 后，用 试剂提取细胞中总蛋白，并用 定量。将定量后的蛋白溶液行 电泳，然后转至 膜，并用 脱脂奶粉封闭 。先分别用（）和（）一抗孵育液在 冰箱中将封闭后的蛋白条带孵育过夜，洗膜后，再用山羊抗兔二抗（）孵育液在 摇床中孵育 。最后加显影液避光显影，凝胶系统曝光拍照，软件分析 相对于 的表达量。双荧光素酶报告基因实验 靶基因预测软件显示，与、与 的核苷酸序列分别存在连续结合位
9、点（见图）。将 细胞接种于 孔板中（个 孔），用 脂质体法，分别共转染 与、与、与、与、与、与、与、与，转染时间为。然后换为含 的 培养基再培养，收集细胞并裂解，经离心（、）后，取上清液，检测荧光素酶活性，结果以萤火虫荧光强度与海肾荧光强度的比值表示。统计学方法 采用 检验、方差分析、检验及相关分析。结果 骨肉瘤组织中 和 的表达及相关性 骨肉瘤组织中 表达量高于瘤旁组织（），而 表达量低于瘤旁组织（）（见表）。相关性分析结果显示，骨肉瘤组织中 与 的表达呈负相关关系（，）。表 骨肉瘤组织中 与 的表达（；）分组瘤旁组织 骨肉瘤组织 下调 对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响 转染 的 细胞中
10、表达量明显低于 组和 组（），而 组和 组 表达量差异无统计学意义（），表明下调 的 细胞构建成功；与 组或 组比较，组 细胞吸光度值和克隆形成数降低（），划痕愈合率和细胞侵袭数降低（），而 组和 组各检测指标比较差异无统计学意义（）（见表）。靶向负调控 共转染 与 的 细胞荧光素酶活性显著低于共转染 与 的 细胞（），而共转染 与 的 细胞荧光素酶活性与共转染 与 的 细胞比较差异无统计学意义（）（见表）。与 组或 组比较，组 细胞中 表达量降低（），而 表达量升高（）（见表）。蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期表 下调 对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响（；）分组吸光度值克隆数划痕愈合率
11、侵袭数 组 组 组 组内 检验：与 组比较；与 组比较 表 荧光素酶活性检测结果（；）分组 表 下调 对骨肉瘤细胞中 表达的影响（，）分组 组 组 组 组内 检验：与 组比较；与 组比较 靶向 影响骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭 与 组和 组 比 较，组 细胞中 表达量降低，细胞吸光度值和克隆形成数升高（），划痕愈合率和细胞侵袭数升高（），而 组与 组各检测指标比较差异均无统计学意义（）（见表 和图）。靶向负调控 双荧光素酶活性检测结果显示，共转染 与 的 细胞荧光素酶活性显著低于共转染 与 的 细胞（），而共转染 与 的 细胞荧光素酶活性与共转染 与 的 细胞比较差异无统计学意义（）（见表）。同
12、时，与 组或 组比较，组 细胞中 表达量升高（），而 蛋白表达量降低（）（见表 和图）。靶向 影响骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭 与 组比较，组 细胞吸光度值和克隆形成数降低（），划痕愈合率和细胞侵袭数降低（）；而与 组比较，组 细胞吸光度值和克隆形成数升高（），划痕愈合率和细胞侵袭数升高（），组与 组各检测指标比较差异无统计学意义（）（见表 和图）。表 靶向 影响骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭（；）分组吸光度值克隆数划痕愈合率 侵袭数 组 组 组 组内 检验：与 组比较；与 组比较 ，表 荧光素酶活性检测结果（；）分组 表 上调 对骨肉瘤细胞中 蛋白表达的影响（；）分组 组 组 组 组内 检验：与
13、组比较；与 组比较 讨论 骨肉瘤是一种间质细胞来源的恶性肿瘤，其侵袭性强，易复发和转移。骨肉瘤细胞的异常增殖及迁移和侵袭是其发生发展的主要原因，抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭可起到治疗骨肉瘤的作用。近年来，随着分子生物学的快速发展，发掘影响骨肉瘤发生发展的基因分子对骨肉瘤的诊断和治疗具有重要意义。在真核生物中广泛存在，其可发挥 分子海绵作用，调控 靶基因 的 表 达，进 而 影 响 细 胞 生 命 活 动。、和 等多种 在骨肉瘤中表达升高，促进骨肉瘤细胞的恶性表型，可能是骨肉瘤治疗的潜在分子靶点。表 靶向 影响骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭（；）分组 蛋白吸光度值克隆数划痕愈合率 侵袭数 组 组
14、 组 组 组内 检验：与 组比较；与 组比较 作为一种，在多种肿瘤中表达增加，对 肿 瘤 发 展 起 促 进 作 用。例 如，胃 癌 中 表达上调，其可通过靶向抑制 的表达间接调控 信号转导，促进胃癌细胞的增殖活性、迁移和侵袭，进而促进胃癌发展；在结直肠癌组织和细胞系中表达上调，其可通过靶向 轴和 信号通路促进结直肠癌细胞生长和侵袭；下调 可通过靶向上调 降低口腔鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，可作为口腔鳞癌治疗的分蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期子靶点。本研究结果显示，骨肉瘤组织中 的表达明显高于瘤旁组织，而下调 阻碍了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示 在骨肉瘤发生发展中起促进作用，
15、其可能是骨肉瘤治疗的分子靶点。为了进一步探讨 促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制，本研究证实了 可靶向结合并负调控，骨肉瘤组织中 与 呈负相关关系。在结肠癌、胰腺导管腺癌、乳腺癌和膀胱癌等肿瘤中均表达降低，通过上调 的表达可抑制肿瘤细胞的恶性表型，进而抑制肿瘤发展进程。本研究结果显示，在骨肉瘤中表达减低，而上调 降低了骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭性，说明 对骨肉瘤发展起抑制作用。本研究还显示，下调 逆转了下调 对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，进一步提示 通过靶向抑制 来促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。此外，本研究证实了 是 的靶基因。基因位于染色体 ，是一种转录因子，其蛋白产物在不
16、同肿瘤中发挥不同的生物学作用。在食管癌、卵巢癌和肺癌等肿瘤中表达升高，发挥促癌基因作用；而 在结肠癌和膀胱癌等肿瘤中表达降低，作为抑癌基因起作用。本研究显示，下调 降低骨肉瘤细胞中 蛋白表达，而上调 逆转上调 对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响，进而提示 通过竞争性结合 进而上调 的表达来促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。综上，在骨肉瘤组织中表达升高，其可靶向 轴促进体外骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭，其可能是骨肉瘤治疗的分子靶点。但本研究尚需要在体内证实 轴对骨肉瘤发生发展的影响。参考文献 邹敏，徐金军 苦参碱对人骨肉瘤 细胞增殖，凋亡的影响及机制 中国临床药理学杂志，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：李伟，汪礼军，唐鹏，等 血清 在骨肉瘤病人诊断及预后中的价值 蚌埠医学院学报，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：丁延晶，王立新，邱静怡，等 下调 靶向调控 影响口腔鳞癌 细胞增殖，侵袭以及迁移的分子机制 分子诊断与治疗杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（本文编辑 刘
