1、 第 31 卷第 1 期 2023 年 3 月 纤 维 素 科 学 与 技 术 Journal of Cellulose Science and Technology Vol.31 No.1 Mar.2023 文章编号：1004-8405(2023)01-0071-07 DOI:10.16561/ki.xws.2023.01.07 青藏高原地区纤维素分解菌研究进展青藏高原地区纤维素分解菌研究进展 王雪韧1,2，张湑泽1,3,4*（1.青海民族大学 生态环境与资源学院，青海 西宁 810007；2.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010018；3.青海省特色经济植物高值化利用
2、重点实验室，青海 西宁 810007；4.国家民委青藏高原资源化学与生态环境保护重点实验室，青海 西宁 810007）摘 要：简单概述了纤维素分解机制及影响其分解速率的相关因素，详细综述了在青藏高原特殊环境下纤维素分解菌的研究进展，对来自于自然环境中及高原世居动物消化系统中的纤维素分解菌进行了介绍，随后对纤维素酶在各个行业中的应用进行了阐述。最后针对其发展前景进行展望，为高原地区纤维素酶的开发利用提供理论基础。关键词：青藏高原；纤维素酶；降解机制；土壤微生物；动物消化系统 中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 纤维素类物质作为目前地球上分布最广、含量最丰富的可再生生物质资源1，如果能通过
3、纤维素酶将其分解为可利用的物质，解决纤维素资源难以利用的问题，将对人类社会可持续发展具有重大意义。目前降解纤维素的主要方法有酶解、酸解和微生物降解。酸解耗能巨大，且对环境污染严重，酶解和微生物降解耗能小，但须依靠纤维素降解微生物。因此，筛选纤维素降解微生物，采用生物降解的方法开发利用生物质能源不仅能缓解能源危机，还能在很大程度上保护生态环境2。常见的纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及-葡萄糖苷酶3。现阶段对于纤维素酶的论述主要集中于对其结构或作用机制4-5的探讨以及纤维素酶在各个行业6-7的应用。同时，也有部分学者针对纤维素酶的产生以及影响其产生的因素8-9进行说明。为了更好的将纤
4、维素酶的特性利用于各行各业，有学者专门从分子水平对纤维素酶进行改造10-12，以期获得具有更加符合相应条件的纤维素酶。本文对青藏高原地区特殊环境下纤维素分解菌开展论述，重点综述了近年来从高原环境及世居动物消化系统筛选的纤维素分解菌，为高原地区开发利用以纤维素为代表的可再生生物质能源提供理论基础。1 纤维素分解菌降解概述 1.1 纤维素分解菌降解机制 纤维素酶对纤维素的降解机制先后有很多假说。第一种是协同作用假说，该假说认为纤维素酶的各个组分之间存在着某种协同作用，其降解过程也是由 C1 酶、Cx 酶和 BG 酶来协同完成13，且各组分之间的 收稿日期：2023-02-28 基金项目：青海民族大
5、学校级规划项目（2021XJXS22）；青海民族大学教学改革项目（2021-JYYB-014）；青海省自然科学 基金项目（2020-ZJ-965Q）；青海民族大学大学生创新创业训练计划项目（DCXM-2021-21）。作者简介：王雪韧（1998），男，安徽宿州人，硕士；研究方向：土壤微生物。*通讯作者：张湑泽（1987），男，副教授；研究方向：高原微生物资源开发利用。 72 纤 维 素 科 学 与 技 术 第31卷 不同含量直接影响该酶的水解效果。Wood14发现青霉菌 Penicillium funiculosumde 和赤木霉菌 Trichoderma reesei 所产的纤维素酶在对微晶
6、纤维素和棉纤维进行水解时具有协同性。第二种是由 Reese 在 1950 年所提出的 C1-Cx 假说15，此假说认为首先是外切葡聚糖酶 C1 作用到结晶区，随后内切葡聚糖酶 Cx 的大分子多糖水解生成纤维二糖,最后再由-葡萄糖苷酶 BG 水解生成单糖葡萄糖。但该学说并没有解释 C1 酶的作用机理，虽有人猜测 C1 酶很可能作用于纤维素内的其他键，但该猜想并未得到证实。第三种是由 Enari所提出的顺序假说16，与 C1-Cx 假说相反，该假说认为先是 Cx 酶作用于结晶区，然后 C1 酶作用于长链大分子，最后再由BG酶水解生成单糖葡萄糖。目前纤维素酶真正的降解机制仍不清楚，但Withers和
7、Street17证实了在纤维素的酶解过程中有保留型和反转型两种降解机制。在这三种假说中，协同作用假说是目前最为广泛接受的假说。不同于其他假说，该假说中纤维素酶的顺序并不固定。虽说利用协同作用假说可以解释多数纤维素的降解机理，但对于天然纤维素结晶区的降解机制等部分理论还是无法阐明。图 1 纤维素酶组分协同分解纤维素18 1.2 影响纤维素酶活力的因素 温度、pH、金属离子是影响纤维素酶解速率的重要因素。在测定纤维素酶活力时发现，随着温度的逐渐升高，纤维素酶活力曲线呈现“增长-下降”的抛物线趋势。不同的酶最适反应温度不同，排除具有极端耐受性质的耐热纤维素酶，大多数纤维素酶的最适温度都为 40501
8、9。研究表明，酸性纤维素酶最适pH 为 4.8 左右，中性纤维素酶的最适 pH 在 5 和 7.4 之间，碱性纤维素酶的最适 pH 为 9 左右20。金属离子可以作为纤维素酶的活性基成分，也可以作为酶的激活剂21。Mn2+、Na+、K+等离子对于纤维素酶具有激活作用，而 Cu2+则对纤维素酶起到抑制作用。表面活性剂对纤维素酶的活性具有较大影响，阳离子表面活性剂可与酶蛋白结合从而使酶永久失活22，阴离子表面活性剂对于纤维素酶的催化反应具有抑制作用23。2 青藏高原地区纤维素分解菌筛选 2.1 青藏高原地区土壤纤维素分解菌筛选 青藏高原海拔高，低温缺氧，其独特的自然环境使得微生物演化出了特有的生理
9、适应机制24-25。在高寒草甸、高寒湿地、高山灌丛土壤中都存在纤维素分解菌。青藏高原高海拔地区对气候变化极为敏感，冷暖季明显，土壤反复性冻融交替，影响土壤微生物组成。短期外源碳、氮输入会显著增加土壤微生物数量和丰度，也提高了土壤纤维素酶活性26-27。植物的入侵会导致土壤全碳（TOC）、全氮（TON）和微生物碳含量显著增加，根际土中纤维素酶含量高于非根际土28，杂草和毒草的入侵会造成高寒草甸土壤微生物群落结构改变，对植物群落结构和生产力具有明显影响。张梦君等29从西藏高海拔的植物根际土壤中筛选具有高效降解纤维素能力的低温真菌，分离筛选到一株高效产纤维素酶的低温真菌 NLS-2，该菌株为青霉菌（
10、Penicillium），可在低温条件下生长并具有较强的产纤维素酶能力，具有良好的应用前景。朱攀等30 第 1 期 王雪韧等：青藏高原地区纤维素分解菌研究进展 73 通过对青藏高原垫状点地梅垫状结构中的耐冷纤维素酶产生菌进行筛选，最终得到 52 株 14 属 32 种耐冷纤维素酶产生菌，包括 3 种细菌、9 种酵母菌和 20 种丝状真菌；何特等31从青藏高原若尔盖高寒湿地距离地表 80 cm 土壤中筛选出一株高效产纤维素酶的兼性厌氧菌 H-2，经鉴定该菌株为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。青藏高原上广泛分布着数量众多的湖泊，大部分是咸水湖，在湖水中也存在着产纤维素酶的嗜盐微生物
11、。张欣等32通过高通量测序技术对茶卡盐湖底泥中的细菌和古菌进行测序，发现茶卡盐湖中的细菌以厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主，古菌以广古菌门（Euryarchaeota）为主，从以上微生物中挖掘产纤维素酶的嗜盐微生物；郭璟33从青海盐湖中分离出耐盐菌株 G5 和 G8，分别为芽孢杆菌（Bacillus）和盐单胞菌（Halomonas），经测定均具有较高的酶活；谢占玲34从青海湖中分离出 617 株耐盐真菌，展示了青海湖中丰富的耐盐真菌资源。通过对青藏高原高寒草甸、高寒湿地甚至盐湖中嗜盐嗜冷纤维素降解菌株的筛选与
12、酶学特性研究，以期寻找到新的纤维素酶资源，为青藏高原地区资源利用提供依据。表 1 青藏高原不同生境纤维素酶产生菌筛选 筛选地区 主要菌株 优势 参考文献 西藏植物根际土壤 青霉菌 NLS-2 耐冷 张梦君等29 青藏高原垫状点地梅 3 种细菌、9 种酵母菌、20 种丝状真菌 耐冷 朱攀等30 若尔盖高寒湿地 蜡样芽胞杆菌 H-2 高效产纤维素酶 何特等31 茶卡盐湖底泥 产纤维素酶嗜盐微生物 耐盐 张欣等32 青海湖土样 芽孢杆菌 G5、盐单胞菌 G8 耐盐 郭璟等33 青海湖土、水样 枝孢菌属、青霉菌、曲霉 耐盐 谢占玲等34 2.2 动物消化系统纤维素分解菌筛选 1906 年，纤维素酶首次
13、由 Seilliere 在蜗牛的唾液中发现。目前为止，在反刍动物瘤胃，昆虫，动物肠道内均有发现纤维素酶的报告35。反刍动物瘤胃内存在着大量的细菌、真菌、原生动物等，借助自身瘤胃里的微生物分解食物中的纤维素，目前已发现在动物的瘤胃中存在一些真菌和细菌分泌纤维素酶。2003 年，王骥等36在福寿螺体内发现了多功能纤维素酶 EGX；Zhao 等37从牦牛瘤胃中分离出了能够高产纤维素酶的菌株粪肠球菌（Enterococcus faecalis）EF85 和 EF83；刘锁珠等38从西藏猪粪中分离出高效纤维素降解菌株解淀粉芽孢杆菌 TL106，其 1,4-d 葡聚糖酶和-1,4-葡萄糖苷酶的内切值分别为
14、 86.34 U/mL和 65.54 U/mL；Leng 等39从青藏高原牦牛粪便中分离出一株碱性纤维素酶产生菌株 Tibet-YD4524-3，经鉴定，该菌株属于链霉菌属（Streptomyces），菌株所产纤维素酶在 40、pH8.5 时具有最佳活性。以上研究进一步证实在动物体消化道内筛选纤维素酶产生菌株的可能性。但不同动物来源的纤维素酶具有不同的性质，因此寻找不同动物来源的高活性纤维素分解菌是重要的研究方向。青藏高原特殊的地理环境影响了高原动物生存，在高原恶劣的自然环境下，高原动物具有很强的适应能力，其消化系统代谢机制也具有明显的适应性，使得青藏高原世居动物消化系统纤维素产生菌的研究具有
15、重要意义。毛婷等40从甘肃省天祝县牦牛粪便中分离产纤维素酶短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），羧甲基纤维素酶活最高为 520U/mL，在秸秆降解方面具有潜在研究价值；李师翁等41从青藏高原采集的牦牛粪中经过 CMC 平板分离得到一株产纤维素酶能力较强菌株 Tibet-YD5227-2，经初步鉴定为链霉菌属；徐淑琴等42以藏羊瘤胃液为原料，从中筛选出菌株 BS1-q1，经鉴定该菌株为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）；Gao 等43对青藏高原特有的马科动物藏野驴（Equus kiang）粪便进行 16S rRNA 测序，发现藏野驴肠道优势菌门均为拟杆菌门（Bacte
16、roidetes）和厚壁菌门（Firmicutes），其中厚壁菌门部分微生物在藏 74 纤 维 素 科 学 与 技 术 第31卷 野驴纤维素分解中具有重要的作用，它们能够帮助藏野驴分解纤维质食物，获取能量。沙玉柱44对甘肃甘南州藏系绵羊冷季和暖季瘤胃液中纤维素酶活性分析发现冷季瘤胃液中纤维素酶活性明显升高，菌群研究发现，拟杆菌门在冷季显著升高，厚壁菌门在冷季显著降低，其中普氏菌属（Prevotella）、理研菌科（Rikenellaceae）在冷、暖季均为优势菌属，理研菌科在冷季相对丰度显著升高，瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、绒毛杆菌科（Muribaculaceae）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）和琥珀酸菌（Succiniclasticum）在冷季显著降低。该研究鉴定出许多纤维素分解菌，如瘤胃球菌属（Ruminococcus）、纤维杆菌属（Fibrobacter）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、密螺旋体属（Treponema）、假丁酸弧菌（Pseudobutyrivibrio）等都能够分解纤维素。冯天舒等45通过 16S rRNA 基因测序，定量 PC
