1、3期细胞运动和侵袭以及肿瘤发生和转移是癌症恶性潜能的特征，转移是导致癌症死亡的主要原因1，大约 15%的结直肠癌患者发生转移后，其平均生存时间不到 3 年2。肿瘤微环境可以促进肿瘤的进展3，来自原发性肿瘤的机械应力可诱导非转化的相邻细胞群中的致瘤信号传导，进而促进细胞生长和肿瘤增加。同时，生物力学可以通过在转化细胞中诱导间充质样开关来驱动肿瘤攻击，使它们获得肿瘤起始特性4。Piezo2 作为机械力活化的离子通道，将机械应力-细胞内信号-癌症紧密地联系在一起，参与结直肠癌的发生发展。本研究主要通过对人结肠癌细胞系 SW620和 HCT116 细胞的 Piezo2 表达进行干预，检测两种细胞在干预
2、前后增殖、迁移、侵袭能力的变化。1资料与方法1.1细胞与主要试剂NCM460（人正常结肠上皮细胞系）、SW480（原发结肠腺癌细胞系）、HCT116（原位肠癌细胞系）和 SW620（结肠癌淋巴结转移细胞系）均购于美国 ATCC 细胞库。RPMI-1640 培养基（美国GIBCO 公司），McCoy s 5A 培养基（美国 GIBCO 公司），Leibovitz s L-15 培养基（美国 GIBCO 公司），蛋白含量检测试剂盒、凯基全蛋白提取试剂盒、彩色蛋白 Maker（江苏凯基生物技术有限公司），胎牛血清（BI 公司），PVDF 膜（美国密理博公司），Transwell 小室（CORNING
3、 公司），ki67 抗体（Abcam 公司），重组慢病毒 LV-Piezo2-RNAi、阴性对照病毒 CON313、HiTransGP 病毒感染试剂（上收稿日期：2022-08-23基金项目：国家自然科学基金项目（81960526）作者简介：张浩鹏（1996），男，在读硕士研究生，从事结直肠肿瘤临床及基础研究工作。通信作者：李海（1971），男，博士研究生导师，教授，主任医师，从事结直肠肿瘤临床与基础研究工作。E-mail：敲低 Piezo2 对人结肠癌细胞 HCT116 和 SW620增殖、迁移和侵袭的影响张浩鹏1，张丽君2，纪琴1，侯少华1，常鑫1，李海3（1.宁夏医科大学临床医学院，银川
4、750004；2.济宁医学院附属医院兖州院区呼吸内科，济宁272000；3.宁夏医科大学总医院结直肠外科，银川750004）摘要：目的探讨敲低机械敏感性离子通道 Piezo2 对人结肠癌细胞 HCT116 和 SW620 增殖、迁移侵袭能力的影响。方法采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）及蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测结直肠癌组织及其相应癌旁组织中 Piezo2 的 mRNA 和蛋白表达情况；Western blot 检测 Piezo2 在正常结肠上皮细胞 NCM460、结肠癌细胞 SW480 和 HCT116、结肠癌淋巴结转移细胞 SW620 的表达；将 HCT11
5、6、SW620 细胞系稳定转染Piezo2 敲低慢病毒载体，利用 RT-qPCR 和 Western blot 检测转染后 HCT116 和 SW620 细胞的 Piezo2 表达情况；CCK-8 法检测转染后 HCT116 和 SW620 细胞的增殖能力；Transwell 法和细胞划痕修复实验检测转染后HCT116 和 SW620 细胞的侵袭和迁移能力；通过裸鼠皮下成瘤检测 HCT116 和 SW620 细胞敲低 Piezo2 后肿瘤大小变化，通过免疫组化检测 ki67 表达。结果RT-qPCR 及 Western blot 实验显示，癌组织 Piezo2 的 mRNA 和蛋白表达均高于癌
6、旁组织（P 均0.05）；Western blot 结果显示，Piezo2 在 SW620、SW480 和 HCT116 细胞中的表达均高于正常肠上皮细胞（NCM460）（P 均0.05）；在 HCT116 与 SW620 细胞内成功敲低 Piezo2 表达；CCK-8 检测结果显示，敲低 Piezo2 表达抑制了 HCT116 和 SW620 细胞的增殖能力；敲低 Piezo2 表达能抑制HCT116 和 SW620 细胞的侵袭能力（P 均0.01）；敲低 Piezo2 表达可以抑制 HCT116 和 SW620 细胞迁移能力（P均0.01）；皮下成瘤结果显示，Piezo2 敲低组肿瘤体积和
7、质量少于对照组（P 均0.01），免疫组化检测显示Piezo2 敲低组肿瘤组织中的 ki67 表达弱于对照组（P0.01）。结论敲低人结肠癌细胞 HCT116 和 SW620 的机械敏感性离子通道 Piezo2 表达后，其增殖、侵袭、迁移能力降低。关键词：结直肠癌；机械应力；Piezo2；侵袭；迁移中图分类号：R735.3文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.03.005文章编号：1674-6309（2023）03-0243-07论著张浩鹏，等.敲低Piezo2对人结肠癌细胞HCT116和SW620增殖、迁移和侵袭的影响第 45 卷3 期2023
8、年 3 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University243宁夏医科大学学报45卷海吉凯基因医学科技有限公司），Trizol 试剂（美国赛默飞公司），反转录-荧光定量试剂盒（天根生化科技北京有限公司），Piezo2 及 GAPDH 引物由上海生物工程有限公司设计合成，GAPDH 抗体（北京博奥森生物技术有限公司），Piezo2 抗体（Abcam 公司）、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（ABclonal 公司）、Western blot 高敏型 ECL 化学发光检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。1.2实验分组阴性对照组（
9、LV-NC）为阴性慢病毒转染的稳定细胞系，转染敲低组（LV-shPiezo2）为慢病毒敲低 Piezo2 的稳定转染细胞系。1.3实验方法1.3.1实时荧光定量 PCR 检测癌组织及癌旁组织 Piezo2 的 mRNA 表达使用 Trizol 试剂提取组织和细胞中的总 RNA，运用反转录试剂盒将RNA 逆转录成 cDNA，运用 SYBRTMGreen Mix 试剂进行实时荧光定量 PCR 实验，引物序列为：Piezo2：正向：5 ATGGCCTCAGAAGTGGTGTG3，反向：5 ATGTCCTTGCATCGTCGTTTT 3；GAPDH：正向：5 AATGGACAACTGGTCGTGGAC
10、3，反 向：5-CCCTCCAGGGGATCTGTTTG3。反应条件为：在 PCR 仪中预变性 10 min、95 1 个循环，然后 95 15 s，62 30 s 进行40 个循环。mRNA 相对表达水平的计算采用2-Ct法。1.3.2蛋白免疫印迹实验检测癌组织及癌旁组织 Piezo2 的蛋白表达取组织或者细胞，RIPA裂解液提取蛋白后用 BCA 试剂盒进行蛋白定量，取 40 g 总蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，然后将蛋白转膜到 PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，加入稀释后一抗 4 孵育过夜，次日用TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，加入稀释后二抗室温孵育 1 h，T
11、BST 洗膜 3 次，每次 10 min，滴加高敏 ECL 化学发光液后于化学发光仪下曝光拍照，以目的蛋白与内参蛋白积分灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。1.3.3Piezo2 敲 低 慢 病 毒 转 染 HCT116 和SW620 细胞按照慢病毒转染试剂说明书，将HCT116 细胞和 SW620 细胞密度调整至 3104个/mL，取 500 L 加入 24 孔板，细胞密度在 20%30%时加入对应感染复数（MOI）的慢病毒，转染Piezo2 敲低慢病毒和对照空载慢病毒于 HCT116细胞和 SW620 细胞中，然后用嘌呤霉素筛选转染敲低 Piezo2 的 HCT116 细胞和 SW620
12、细胞，进而得到稳定敲低的 HCT116 和 SW620 细胞。1.3.4CCK-8 法检测细胞增殖在 96 孔板中加入 100 L（细胞量约为 7 000 个）的 HCT116、SW620 细胞悬液。培养板在培养箱预培养 24 h（在 37，5%CO2的条件下）。细胞培养至相应时间（0、6、12、24、48、60、72 h）分别加入 10 L 的CCK-8 溶液，将细胞继续培养 2 h，用酶标仪测定在 450 nm 处的光密度（OD）值。1.3.5Transwell 法检测细胞侵袭能力提前将用不含血清的 McCoy s 5A 和 Leibovitz sL-15 培养基稀释的 matrigel
13、胶（1 mg mL-1）铺到小室上层底部，将转染前后 HCT116 和 SW620 细胞，用不含血清的 McCoy s 5A 和 Leibovitz sL-15 培养基将细胞调整至浓度为 1105个/mL 的细胞悬液，向 24 孔 Transwell 小室的上层加入 200 L细胞悬液。随后向小室下层加入 500 L 含有10%FBS 的 McCoy s 5A 和 Leibovitz s L-15 培养基，培养箱孵育 24 h。小室从培养箱取出，吸净小室上下层的培养基，用干净棉签以适当力度擦去Transwell 上层小室内残留的基质胶、细胞，多聚甲醛固定，结晶紫染色，水分风干后显微镜拍照并使用
14、 Image J 软件进行细胞计数。1.3.6细胞划痕实验检测细胞迁移能力取LV-NC 组和 LV-shPiezo2 组的 HCT116 和SW620细胞，按 5105个/mL 细胞密度接种于 6 孔板中，每孔 1 mL，于培养箱内培养，待细胞汇合度达到80%90%时，使用 100 L 移液枪头对 6 孔板进行划痕，PBS 清洗后加入相应的 McCoy s 5A 和Leibovitz s L-15 无血清培养基，按时间点 0、24h 进行拍照，使用 Image J 图像分析软件比较细胞划痕的间距。1.3.7裸鼠皮下移植瘤模型制备及其增殖能力检测选用 3 周龄的 BALB/c-Nude 裸鼠，待
15、裸鼠适应环境后开始实验。选择对数生长期且状态良好的未处理的以及分别转染敲低 Piezo2 和空载慢病毒的 HCT116 和 SW620 细胞，常规消化并计数，用无血清培养基调整密度至 1107个/mL的细胞悬液置于冰上待用。用 1 mL 注射器抽取 0.2 mL（2106个细胞）皮下接种于一侧腋下，接种后每周 3 次观察，并记录肿瘤的大小和质量，直至第3 周肿瘤大小成型后处死裸鼠并测量肿瘤体积和质量。1.3.8免疫组织化学法检测皮下肿瘤中 ki67表达。裸鼠皮下移植瘤，石蜡包埋固定，切片，烤片 3 h 脱蜡、脱水，柠檬酸盐高压修复后 3%H2O22443期Piezo2 mRNA 相对表达量癌旁
16、组织癌组织*43210ABC癌旁组织癌组织癌旁组织癌组织*543210Piezo2 相对表达量Piezo2GAPDH室温孵育以消除内源性过氧化物酶的活性，10%正常山羊血清封闭后滴加一抗 ki67（1300）工作液，4 下孵育过夜，抗鼠二抗孵育 1 h，苏木素染色、盐酸乙醇分化、清水反蓝，脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，于 Leica 正置显微镜下观察并拍照，使用 Image J 和 GraphPad Prism 8.0 统计软件作图。结果判定标准：ki67 染色标准以细胞核出现清晰棕色或棕褐色、棕黄色颗粒为阳性细胞。1.4 统计学方法采用 Image J 和 GraphPad Prism 8.0 软件进行细胞计数和统计分析绘图，计数资料比较用 2检验。计量资料以均数标准差（xs）表示，组间比较用 Student s t-test、单因素方差分析。检验水准取=0.05。2结果2.1在人结直肠癌组织中 Piezo2 高表达、癌旁组织中低表达通过 RT-qPCR 及 Western blot 实验分别检测癌组织及其相应癌旁组织中 Piezo2 的 mRNA和蛋白表达情况，结果显示,癌组织
