1、824安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 11：28：19 网络出版地址:h t t ps：/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1341.020.h t ml妊娠期肝内胆汁淤积症大鼠肝损伤及其肠道菌群结构的研究何刘媛I,张 彬I,张和平I,沈继龙2,徐元宏2,沈续航彳摘要目的探讨妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)大鼠模型 肝胆代谢特点及对肠道菌群的影响。方法 取孕10 d的SD 大鼠40只，随机分为对照
2、组(15只)和ICP组(25只)。妊 娠第10 14天给予ICP组大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇(2.5 mg/k g)联合黄体酮(75 mg/k g)，构建动物模型，同期对照组 给予生理盐水(2.5 ml/k g)腹腔注射。用药后第6天分别检 测两组大鼠血清总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰氨基转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)和总胆汁酸(TBA)水平，比较两 组实验大鼠生化指标。取两组大鼠肝脏，病理切片及HE染 色，观察ICP大鼠肝脏病理变化。同时收集ICP大鼠新鲜粪 便进行16Sr DNA测序。结果ICP组大鼠血清TBIL、ALT、AS
3、T、GGT、ALP和TBA水平均显著高于对照组(P 0.05)。与对照组比较,ICP组大鼠肝细胞出现显著的脂肪变性，并 伴有点状坏死和炎性细胞浸润,部分可见胆栓形成。ICP大 鼠肠道菌群出现紊乱，表现为真杆菌、狄氏副拟杆菌、单形拟 杆菌等丰度显著下降(P 0.05)，而普氏菌和梭杆菌等显著 升高(P 0.05)o结论ICP大鼠出现肝组织和肝功能损 伤,伴有胆汁酸代谢障碍,并导致母体肠道菌群紊乱O 关键词 妊娠期肝内胆汁淤积症;大鼠模型;肠道菌群;16S r DNA中图分类号 R372；R575文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0824-06 d o i:10.19405
4、/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.020妊娠期肝内胆汁淤积症(in t r a h epa t ic c h o l est a sis o f pr eg n a n c y,ICP)常见于孕中晚期。我国孕妇的患 病率低于国外报道,但仍达0.95%6.00%1 2 3o本 病主要表现为皮肤瘙痒、肝功能异常、进行性黄疸和 血清总胆汁酸(t o t a l bil e a c id,TBA)水平升高等，严 2022-11-17 接收基金项目：病原生物学安徽省重点实验室开放课题(编号=2022013)作者单位安徽省妇幼保健院(安徽医科大学妇幼医学中心)检验科，合
5、肥 2300012安徽医科大学第一附属医院检验科，安徽省病原生物学 重点实验室，合肥2300223安徽医科大学第一附属医院消化内科，合肥230022作者简介:何刘媛,女，主管技师；徐元宏，男，教授，主任技师，博士生导师，责任作者,E-ma il:x y h o n g l 964 163.c o m重者可导致早产、死胎及新生儿抑郁和呼吸窘迫综 合征等S3。母体孕期肠道和生殖道菌群均有明显 改变,以适应胎儿宫内发育和分娩，并为出生婴儿体 内菌群的定植做准备。母体肠道共生菌产生的 短链脂肪酸(sh o r t-c h a in f a t t y a c id s,SCFAs)参与了 孕妇脂质代谢
6、和糖代谢，对于维持妊娠发挥了至关 重要的作用。已知肠道菌群的丰度和多样性与 宿主的年龄、孕期、居住地、饮食习惯和健康状态密 切相关。既往的临床病例研究尚未揭示ICP与肠道 菌群变化的因果关系,ICP实验动物模型对肠道菌 群及其对代谢的影响鲜见报道。该研究建立了 ICP 大鼠模型，探讨ICP对肝脏损伤、胆汁酸代谢以及肠 道菌群的影响，旨在为ICP发病机制研究和临床诊 治提供实验依据。1材料与方法1.1实验动物 清洁级SD大鼠购自济南朋悦实 验动物繁育有限公司，雌性大鼠40只,6周龄，体质 量220-270 g,有生育能力的雄性大鼠13只。在室 温18-28七、相对湿度40%-70%的环境内饲养，
7、自由饮水和饮食，适应环境1周。发情期按雌雄比 例3：1合笼饲养，每日观察阴栓脱落情况,将阴栓 脱落日定为妊娠第1天,饲养至妊娠第10天待用。所有动物试验操作符合中华人民共和国实验动物 管理条例(2021)要求。1.2主要试剂与仪器苯甲酸雌二醇注射液、黄体 酮注射液(上海全宇生物科技有限公司)；全自动生 化仪a u 5800(美国贝克曼公司)；奥林巴斯BX50系 列生物显微镜(日本奥林巴斯公司)；组织病理切片 机RM2016(德国探卡公司)；其余器材由病原生物 学安徽省重点实验室提供。1.3 ICP大鼠模型制备 将妊娠第10天的SD大 鼠40只随机分为对照组15只和ICP组25只。妊 娠第10
8、14天分别给予对照组大鼠腹腔注射生理 盐水2.5 ml/k g,ICP组大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇 2.5 mg/k g联合黄体酮75 mg/k go以上药物每天注 射1次，连续注射5 do安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)8251.4标本采集与检测 妊娠第15天采用无菌滤纸 收集各组大鼠粪便，-80咒临时保存，用于肠道菌 群16S r DNA测序。各组大鼠腹腔注射6%水合氯 醛溶液250 mg/k g麻醉，分别取静脉抗凝血2 ml,1 500 r/min离心10 min,取上层血清，应用全自动 生化分析仪测
9、定血清中总胆红素(t o t a l bil ir u bin,TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(a l a n in e a min o t r a n sf er a se,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(a spa r t a t e t r a n sa min a se,AST)、谷氨酰氨基转移酶(g l u t a my l t r a n sf era se,GGT)、碱性磷酸酶(a l k a l in e ph o sph a t a se,ALP)和TBA水平。血清TBA及肝酶水平异常升高即视 为ICP大鼠模型制备成功。大鼠腹腔注射水合氯醛 250 mg/k g,麻醉后留取左叶
10、肝脏1.0 c m X 1.0 c m X 0.5 c m大小,置于10%甲醛溶液中固定48 h；经脱 水、透明、浸蜡制作石蜡组织切片，苏木精-伊红(h ema t o x y l in-eo sin,HE)染色,显微镜下观察肝脏病 理变化。1.5粪便16S rDNA测序 将上述收集的大鼠新 鲜粪便置于无菌收集管中，标记，送上海欧易生物医 学科技有限公司测序分析。采用DNA抽提试剂盒 对样本的基因组DNA进行提取，利用琼脂糖凝胶电 泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管 中，如果有必要则使用无菌水稀释样品至1 n g/pLlo 以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选 择,使用带
11、Ba r c o d e的特异引物，Ta k a r a公司的 Ta k a r a Ex Ta q高保真酶进行P CR,确保扩增效率和 准确性。测序区域16S的引物区域V3-V4前端通 用引物为 343F 5，-TACGGRAGGCAGCAG-3，；后端 引物为 798R 5，-AGGGTATCTAATCCT-3，。P CR 产 物电泳检测,磁珠纯化后作为模板，进行二轮P CR 扩增,并再次电泳检测和磁珠纯化，对P CR产物进 行Qu bit定量。根据P CR产物浓度进行等量混样,并上机测序。1.6统计学处理 采用SP SS 19.0统计软件进行 数据分析，计量资料以力土 s表示，各组大鼠血
12、清生 物化学指标比较采用独立样本t检验。P 0.05示 差异有统计学意义。2结果2.1两组大鼠血清生化指标比较与对照组比较,ICP组大鼠血清反映肝细胞损伤和胆汁酸代谢的 TBIL、ALT、AST、GGT、ALP 和 TBA 等指标，于造模 给药后第6天显著升高(P 0.05,图2A、B)；Bet a多样性的主 成分分析(pr in c ipa l c o mpo n en t a n a l y sis,P CA)显不，对照组和ICP组菌群组成出现显著性差异(P 0.05,图 2C、D)。采用非参数Wil c o x n t检验分析两组大鼠肠道 细菌在门、属和种水平上的差异。结果显示，有8个
13、门的细菌出现了显著变化。ICP组的梭杆菌门(Fu-sobacteriota)和拟杆菌门(Bacteroidota)细菌显著升 高;而丝状杆菌门(Fibrobacterota)、螺旋菌门(Spiro-c/ia et o t a)显著下降(P 0.05,图3A)；在属水平，组表1两组大鼠肝脏生化指标检测比较Gs)组别鼠数(只)TBIL(|x mo l/L)ALT(IU/L)AST(IU/L)GGT(IU/L)ALP(IU/L)TBA(IU/L)对照152.56 0.3045.51 1.67195.71 5.011.59 0.0880.91 1.868.40 0.08ICP256.501.0972.
14、24 3.46317.15 10.802.18 0.63147.43 3.5029.14 0.27/值-1.22-3.35-3.07-1.79-3.29-3.41P值0.050.050.050.050.050.05826安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)A 報罂犁ftgo o60600000414102020o o.51.5.51.5mmmm77.6.77.6.6.5.6.5.B BC C%寸寸.9 zod对照组ICP组一D D 騒 doi0 II-1对照组ICP组0-1-1对照组ICP组-20 0 20
15、40P C1 7.37%-20 0 20 40 60P C1 7.37%图2 Alpha多样性和Beta多样性分析A：Ch a o 1指数值;B：sh a n n o n指数值;C、D：主成分分析海个点代表每一份样本;与对照组比较：*P 0.05间差异的刖10中Cl a d e-HI、副拟杆困(Parabacte-roides)、真杆菌(Eubacterium)、瘤胃球菌(Ruminococ-cus)在ICP组显著降低;而普雷沃菌(Prevotella)、罗 氏菌(Roseburia)、嗜木聚糖真杆菌群组(E.xyl-anophilum group)、梭杆菌(Fusobacterium)在 I
16、CP 组 显著升高(P 0.05,图3B)。进一步在种水平的分 析发现,在ICP组中,单形拟杆菌(Bacteroides unifor-mis)、罗尔斯通菌(Ralstonia insidiosa)、狄氏副拟杆 菌(Parabacteroides distasonis)、Clostridiales bacterium 等显著降低；而猪肠支原体(Metamycoplasma sual-祝)、螺杆菌(Helibacter apodemus)、柯林斯菌(Col-linsela stercoris)等显著升高(P 0.05,图 3C)。2.4肠道标志性菌种、随机森林分析和功能预测 指示性菌种分析主要是指筛选大鼠肠道中能对生长 环境产生较大影响的生物种属或群落。ICP组指示 性菌种中,变形菌、普氏菌和罗氏菌占优势;而益生 菌狄氏副拟杆菌、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)显著减少(图4)。随机森林分析发现，副拟杆菌、梭 杆菌、普拉梭杆菌和志贺氏大肠埃希菌是区分ICP 组和对照组大鼠最重要的前5个重要肠道菌属(图5)。此外，基于16S r DNA测序的KEGG功能预测 发现,
