1、第40 卷第2 期2023年0 6 月Chinese J Magn Reson,2023,40(2):169-178波谱学杂志Chinese Journal of Magnetic ResonanceVol.40 No.2Jun.2023doi:10.11938/cjmr20222993溶液中ATAD2溴结构域聚集行为的研究王远方12,王小花12,舒畅1.2,张许1,2 34,刘买利1,2,3.4,曾丹云1,2*1波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心,中国科学院精密测量科学与技术创新研究院,湖北武汉430 0 7 1;2.中国科学院大学,北京10 0 0 49:3.华中科技大学武汉
2、光电国家研究中心,湖北武汉430 0 7 4;4.湖北光谷实验室,湖北武汉430 0 7 4摘要:三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)是一种染色质调节因子它的异常表达与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关,因此还被称为致癌转录辅助因子.ATAD2由ATP酶结构域和溴结构域组成.其中,溴结构域可以特异性识别并结合组蛋白末端的乙酰化赖氨酸位点,调控染色体重构和转录,但其功能相关的很多结构特征并未可知.我们首先发现ATAD2溴结构域在溶液中易发生聚集然后以核磁共振(NMR)和圆二色谱(CD)为主要研究手段,从环境因素和结构因素两方面对ATAD2溴结构域的聚集机理进行了初步探讨,发现该聚集行为伴有结构变化
3、,并可能与功能相关.本研究可能为ATAD2溴结构域抑制剂的研发提供新的思路.关键词:核磁共振(NMR);A T A D 2;溴结构域;聚集中图分类号:0 48 2.53文献标识码:AThe Aggregation of ATAD2 Bromodomain in SolutionWANG Yuanfangl-,WANG Xiaohual-2,SHU Changl-2,ZHANG Xul.2.34,LIU Maili1.34,ZENG Danyun 1.2*1.State Key Laboratory of Magnetic Resonance and Atomic and Molecular P
4、hysics,National Center for Magnetic Resonance in Wuhan,InnovationAcademy for Precision Measurement Science and Technology,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China;2.University of ChineseAcademy of Sciences,Beijing 100049,China;3.Wuhan National Research Center for Optoelectronics,Huazhong Unive
5、rsity of Science andTechnology,Wuhan 430074,China;4.Optics Valley Laboratory,Wuhan 430074,ChinaAbstract:ATPase family AAA domain-containing protein 2(ATAD2)is a chromatin regulator,also known as an oncogenictranscription cofactor.Its abnormal expression is closely related to the occurrence and devel
6、opment of various malignanttumors.ATAD2 consists of two domains:the ATPase domain and the bromodomain.The bromodomain can specificallyrecognize and interact with the acetylated lysines in proteins,which regulates the refactoring and transcription ofchromosomes.In this work,we found that ATAD2 bromod
7、omains are aggregated under normal solution conditions.Considering the possible impact of aggregation on the interaction between ATAD2 bromodomain and acetylated histone tail,we preliminarily investigated the aggregation of ATAD2 bromodomains mainly by nuclear magnetic resonance(NMR)andcircular dich
8、roism(CD)spectra.The results suggested that the aggregation is accompanied with structure alteration andpossibly related to the physiological functions of cells.This study may provide new clues for the development of ATAD2bromodomain inhibitors.Keywords:nuclear magnetic resonance(NMR),ATAD2,bromodom
9、ain,aggregation收稿日期:2 0 2 2-0 4-0 6;在线发表日期:2 0 2 2-0 5-0 6基金项目:国家重点基础研究发展计划(“9 7 3”计划)资助项目(2 0 17 YFA0505400,2018YFE0202300,2018YFA0704002)通信作者(Corresponding author):*Tel:19947650913,E-mail:.170引言三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATPasefamilyAAAdomain-containingprotein2,A T A D 2)是一种表观遗传调控因子,也被称为致癌转录因子1,2 .有研究表明,ATAD2在人类
10、恶性肿瘤细胞中与多种关键性调控机制相关例如,ATAD2作为E2F转录因子、雌激素和雄激素受体的共同激活因子,可以促进细胞增殖和下游基因的表达,形成扩增环,导致细胞增殖、侵袭和迁移3-5.ATAD2的过表达与肝癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、子宫内膜癌、三阴性乳腺癌等多种癌症相关3,6-11.同时,ATAD2上调还与患者的不良预后有关,常被作为预后标志12 ,这使得ATAD2成为癌症治疗的潜在用药靶点.ATAD2主要由两个结构域组成:ATP酶结构域和溴结构域.ATP酶结构域负责ATP的结合和水解,参与大分子复合体分解、信号转导、细胞周期调节等功能13,14;溴结构域由130 个高度保守的氨基酸组成,可
11、以特异性识别组蛋白末端的乙酰化赖氨酸位点,从而进行染色质共价修饰、调节染色体重构和调控转录15.如图1所示,ATAD2溴结构域结构保守,通常由四个-螺旋(Z、A、B、C)和三段loop区域(ZA-l o o p、BC-l o o p、A B-l o o p)组成。ZA-loop、BC-l o o p 及部分-螺旋形成一个疏水空腔,用于结合乙酰化组蛋白的N尾端.疏水空腔中的一个保守的天冬酰胺残基(N1064)是特异性识别组蛋白尾部乙酰化赖氨酸的重要位点16,17 波谱学杂志BC-looPCN1064C1079BC1057第40 卷ZA-loopAAB-loopC1101图1ATAD2溴结构域的晶
12、体结构(PDB:6 C PS)Fig.1The crystal structure of ATAD2 bromodomain(PDB:6CPS)ATAD2溴结构域属于溴结构域八大家族中的第五家族作为乙酰化染色质的“阅读器”,发挥其功能活性的ATAD2溴结构域通常以单体形式分别识别组蛋白H4N端第5位和第12 位乙酰化赖氨酸(H4K5ac,H4K12ac),或组蛋白H3N端第14位赖氨酸(H3K14ac)17.18 .然而在溴结构域八大家族中,目前已知溴结构域还可以以单体或二聚体形态同时识别含有两个乙酰化位点的氨基酸片段如第二家族的BRD4以单体形式结合H4K5acK8ac、H 4K 12 a
13、c K 16 a c 和H4K16acK20ac,却以二聚体形式结合H4K8acK12acl19,溴结构域抑制剂BAY-850 通过特异性结合ATAD2溴结构域二聚体,从而对其进行选择性抑制2 。最近有文献2 0 报道含溴结构域的蛋白CBP/P300可以与异常乙酰化组蛋白发生淀粉样聚集,溴结构域抑制剂的加入可以减少亨廷顿蛋白淀粉样聚集,说明溴结构域与其淀粉样聚集的形成有关溴结构域的聚集状态与功能密切相关,然而其聚集状态与功能的关系却仍未可知。因此了解溴结构域的聚集对阐明其识别和调控乙酰化蛋第2 期白的机制以及抑制剂的开发都有重要意义.在本文中,我们对ATAD2溴结构域在溶液中的结构特征进行了研
14、究,结果发现,ATAD2溴结构域在溶液环境中易发生多聚,这可能影响其与组蛋白的相互作用形态为了探索其聚集机制,我们进一步利用圆二色谱(circular dichroism,C D)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NM R)技术,对ATAD2溴结构域的聚集过程进行了检测,分析了可能引发多聚的多个因素结果发现温度、pH、离子强度以及半胱氨酸突变均无法阻止该蛋白的聚集,但二硫键对蛋白结构和聚集速率有很大影响推测该结构域的聚集是蛋白结构的特性所致,可能与其在细胞中的分子功能有关.这一发现可能为ATAD2溴结构域抑制剂的研发提供帮助王远方等:溶液中ATAD2溴结构域聚集
15、行为的研究1711实验部分1.1 实验材料羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、咪唑(C;H4N2,Imi d a z o l e)、甘油(C;H:O3,G l y c e r o l)、葡萄糖(Glucose)均购于国药集团化学试剂有限公司,重水(D2O)、15N标记氯化铵(15NH4CI)购于Sigma-Aldrich公司,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、T EV 蛋白酶购于北京索莱宝科技有限公司,卡那霉素购于武汉百腾瑞达生物科技有限公司,二硫苏糖醇(C4H1oO2S2,D T T)购于北京博奥拓达科技有限公司,用于非变性凝胶电泳实验的BeyoGeITMPlus PAGE预制胶、电泳液、非变性
16、凝胶电泳蛋白上样缓冲液均购于碧云天生物科技有限公司.1.2蛋白样品的表达与纯化1.2.1天然丰度的ATAD2溴结构域的表达与纯化天然丰度的ATAD2溴结构域表达与纯化操作流程如下2 1:将重组质粒PET21a(+)-ATAD2转化到R(s)感受态细胞中,加入无抗LB培养基,37、2 2 0 rpm培养30 min后离心重悬,涂菌液于带有卡那霉素抗性的琼脂平板上.将平板置于37 培养箱过夜培养.挑单斑接种到10 0 0 mL卡那霉素抗性的LB中,37、220rpm培养约2 h至OD600在0.8 1.0 之间,加入1.0 mmol/LIPTG,2 2 0 r p m、17 诱导过夜后收菌.菌体沉淀重悬于50 mL缓冲液(50 0 mmol/LNaCl、50 m m o l/L H EPES、3m m o l/L 咪唑、5%甘油,pH7.5)中,10 0 0 bar高压裂菌后,2 0 0 0 0 rpm、40 m i n 离心取上清液,用0.2 2 m的微孔滤膜过滤,上样至Ni柱,用缓冲液A(50 0 m m o l/L Na C l、50 m m o l/L H EPES、5m m o