1、ICs 67.050X O 4中 华 人民 共 和 国 国 家 标 准GB/T229422008蜜头中头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定液相色谱-串联质谱法Determination of cefazolin,cephapirin,cephalexin,cefalonium,cefquinome residues in honey-LC-MS-MS method2008-131发布09-O01实施蚰员雕委检理瓣管槐M酮标踟眩轵国中中发布GB/T22942-2008日 刂 舀本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位:中
2、华人 民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。本标准主要起草人:李学民、母健、曹彦忠、刘晓茂、姜宁、庞 国芳。GB/T 229422008蜂蜜中头孢唑啉、头孢 匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定 了蜂蜜中头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢 喹肟残 留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于蜂蜜 中头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残 留量的测定。本标准 的 方 法 检 出 限:头 孢 唑 啉 为10u g/k g;头孢 匹林、头 孢 氨 苄、头 孢 洛 宁、头 孢 喹 肟 为2.0 ug/kg。2 规范性引用 文件下列 文件
3、 中的条款通过本标准 的引用 而成为本标 准 的条 款。凡是 注 日期 的引用文件,其 随后所 有的修改单(不 包括勘误 的内容)或 修 订版均不适用 于本标准,然 而,鼓 励根据本标准达成协议 的各方研究是 否可使用这些文件 的最新版本。凡是不注 日期 的引用文件,其 最新版本适用于本标准。G T6379.l 测量方法与结果 的准确度(正 确度与精密度)第l 部分:总则与定义(GB/T6379.1200犭,ISo 5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2 测量方 法与结果 的准确度(正确度 与精 密度)第2部分:确定 标 准测 量方法 重 复性 与 再 现 性 的 基 本 方 法
4、(G B/T 6 3 7 9.2 0 4,I S O 5 7 2 5 2:1 9 9 4,I D T)G B/T 6 6 8 2 分析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法(G B/T 6 6 8 2 2 0 0 8,I S O 3 6 9 6:1 9 8 7,M O D)3 原理试样中五种头孢菌素类药物残 留,用磷酸二氢钠缓冲溶液提取,固相萃取柱净化,液 相色谱-串联质谱仪测定,外标法定量。4 试剂和材料除另有说明外,所用试剂均为分析纯。4.1 水:G B/T 6 6 8 2,一级。4.2 甲醇:色谱纯。4.3 乙腈:色谱纯。4.4 磷酸二氢钠(N aH 2 P O 从)。4.5
5、氢氧化钠。4.6 乙酸。4.7 5m o l/L氢氧化钠溶液:称取g 氢 氧化钠(厶.5),用水溶解,定容至100m L。4.8 0.15m o l/L磷酸二氢钠缓冲溶液:称取18.0g 磷酸二氢钠(4.4),用水溶解,定 容至1000m L,然后用氢氧化钠溶液(4.7)调节至 p H=8.5。4.9 标准 物 质:头孢 唑 啉(C A S:2 5 9 5 1 9 9)、头 孢 匹林(C A s:2 4 3 5 6 6 0-3)、头 孢 氨 苄(C A S:1 6 5 4 5 6 7)、头 孢 洛 宁(C A S:5 5 7 5 2 3)、头 孢 喹 肟(C A S:1 1 8 亻4 3 8
6、9 3),纯度 9 9%。4.10 1.O m y m L五种头孢菌素标准储备溶液:准确称取每种标准物质(众.9),分别用水配制成浓度为GB/T2294220081.0m g/m L的标准储各溶液。储各液贮存在-18冰柜中。4.11 五种头孢菌素标准混合工作溶液:根据需要吸取适量的每种头孢菌素标准储各溶液(4.10),用空白样品提取液制成适当浓度的基质混合标准工作溶液。4.12 固相萃取柱:Oa s i s HLB固相萃取柱或相当者,500m g,6m L。使用前依次用5m L甲醇(4.2)、5m L水(4.D和10m L磷酸二氢钠缓冲溶液(4.8)预处理,保持柱体湿润。4.1 3 滤膜:0.
7、2 um。5 仪器5.1 液相色谱-串联 四极杆质谱仪,配有电喷雾离子源。5.2 分析天平:感量0.l mg、0.0 1 g。5.3 固相萃取真空装置。5.4 贮液器:5 0 mL。5.5 微量注射器:2 5 uL,1 0 0 uL。5,6 刻度样品管:5 mL,精度为0.1 mL。5.7 氮气浓缩仪。6 试样制各与保存6.1 试样的制备对无结晶的实验室样品,将其搅拌均匀。对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60的水浴中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,冷却至室温。分出0.5k g 作为试样。制备好的试样置于样 品瓶中,密封,并做上标记。6.2 试样的保存将试样于常温下保存。7 测定步骤7
8、.1 试样溶液的制备称取5g 试样(精确到O.01g)置于150m L三角瓶 中,加人25m I磷酸二氢钠缓 冲溶液(4.8),溶解样品,混 匀,用 氢氧化钠溶液,调 节至 p H=8.5。把样 品提取液移至下接Oa s i s HLB固相萃取柱(4.12)的贮液器中,以3m L/m i n 的流速通过固相萃取柱,先用5m L磷酸二氢钠缓冲溶液洗涤三角瓶并过柱,再用2m L水洗柱,弃去全部流出液。用2m I乙腈洗脱,收集洗脱液于刻度样品管(5.6)中,在40氮气吹干,用 2m L水溶解残渣,摇匀后,过0.2u m 滤膜(厶.13),供液相色谱-串联质谱仪测定。按照上述操作步骤制各空 白样品提取
9、液。7.2 测定条件7.2.1 液相色谱参考条件a)色谱柱:Z O R B A X S C 1 8,3.5 um,1 5 0 mm2.1 mm(内径)或相当者;b)流动相梯度程序及流速见表1;c)柱温:30;d)进样量:2 0 uI 。表1 流动相梯度程序及流速时间/m i n流 速/(I/m i n)水(含 0.l%乙酸)/%乙腈/%0.009505.02.0095.05.02时间/m i n流速/(u L/m i 水(含 0.1%乙酸)/%乙腈/%60.08.0095.05.015.0095.05 07.2.2 质谱 参 考条件GB/T229422008表1(续)a)离子源:电喷雾离子源;
10、b)扫描方式:正离子扫描;c)检测方式:多反应监测;d)电喷雾 电压:5500V;e)雾化气压力:0.0 5 5 M P a;D 气帘气压力:0.0 7 9 M P a;辅助气流速:6L/m i n;h)离子源温度:400;i)定性离子对、定量离子对和碰撞气能量(CE)、去簇 电压(DP)见表2。7.3 液相色谱-串联质谱测定7.3.1 定性测定选择每种待测物质 的1个母离子,2个以上子离子,在 相 同试验条件下,样 品中待测物质 的保 留时间与基质标准溶液中对应物质的保 留时间偏差在 2.5%之内;样 品谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准溶液的谱图中离子相对丰度相 比,偏差不超过表
11、3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物。表3 定性确证 时相对离子丰度的最大允许偏 差以%表 示表2 五种 头孢 菌素 的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量、去簇 电压化合物 中文名称化合物英文名称定性离子对(/9z/z)定量离子对(仞/z)碰撞气 能量/V去簇 电压/V头孢唑啉celazolin456/324456/156456/3241 72 4头孢匹林cephapirin424/292424/152424/292头孢氨苄cephalexin348/158348/174348/158142 z头孢洛宁cealonium4 5 9/1 5 2459/123459/1522 91 8头
12、孢 喹肟cequinome529/134529/396529/1342 11 9相对离子丰度)5020(K5010(K(2010允许的最大偏差 20r 25 30 50GB/T22942-20087.3.2 定量测定用基质标准混合工作溶液(4.11)分别进样,以标准工作溶液浓度为横坐标,以 峰面积为纵坐标,绘制标准工作 曲线。用标准工作 曲线对样品进行定量,样 品溶液 中五种头孢菌素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下,五种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A.1。本方法的添加 回收率数据参见附录B中的表B.1。7.4 平行试验按上述步骤,对 同一试样
13、进行平行试验测定。7.5 空白试验除不称取试样外,均按上述分析步骤进行。8 结果计算试样 中五种头孢菌素残 留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算:x=c 券端式 中:X试样 中被测组分残 留量,单 位为微克每千克(u y k g);c 从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度,单位为纳克每毫升(n g/m L);V试样溶液定容体积,单位为毫升(m L);勿最终试样溶液所代表的试样质量,单位为克(g)。计算结果应扣除空 白值。9 精密度9.1 一般规定本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2规定确定 的,其 重复性和再现性 的值是 以95%的可信度来计算。g.2
14、 重复性在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,试样 中五种头孢菌素添加浓度范围及重复性方程见表4。9.3 再现性在再现性试验条件下,获得 的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,试样中五种头孢菌素添加浓度范围及重复性方程见表4。4表4 五种头孢菌素添加浓度范 围及重复性 限和再现性 限方程单位为微克每千克如果两次测定值 的差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。化合物名称添加浓度范 围重复性限r再现性 限R)g r-0.946 5 lg m 0.725 5lg r:O.946 6 Ig m 0.765 6l g=0.9砝28 1g
15、P,-0.7628=0.135 7 z,z-0.132 6lg r:0.942 7 Ig m 0.761 0lg R:0.956 9 lg m-O.617 6l g R=o.968 01g,z 0.677 110100l g R:0.9 4 9 4 I g m-0.6 4 5 2l g =o.9o 661g-0,6211l g Ji=0.92801g z-0.6885注:/Pl 为两次测定结果的算术平均值。GB/T229422008a妇羽a弋璎口各苌妇口a驷a附 录 A(资 料性附录)五种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图五种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图A.1。头
16、孢匹林头孢喹肟t/min码t/min图A.1 五种头孢菌素标 准物质的多反应监测(MRM)色谱 图GB/T229422008附 录 B(资 料性 附录)回 收 率五种头孢菌素添加浓度及其平均 回收率 的试验数据见表B,1。表B.1 五种 头孢菌素添加浓度及其平均 回收率的试验数据化合物名称闭 孓力 口 冫 攵 吏/(伊 g/k g)平均 回收率/%头孢唑啉10.085.620.089.140.089.6100.091.7头孢匹林86.792.48.095.420.093.8头孢氨苄2.08在.295.398.120 09 1.3头孢洛宁87.24.091.7102.520.094.l头孢喹肟2.093.796.58.091 520.097.9
