1、农业部2630号公告一9一2017前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由农业部科技教育司归口。本标准起草单位：农业部科技发展中心、农业部环境保护科研监测所、上海交通大学、吉林省农业科学院。本标准主要起草人：修伟明、沈平、杨殿林、李昂、李刚、赵建宁、张贵龙、赖欣、皇甫超河、刘红梅、李飞武。I农业部2630号公告一9一2017转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米C0030.3.5及其衍生品种定性PC方法1范围本标准规定了转基因抗虫耐除草剂玉米C0030.3.
2、5转化体特异性普通PCR检测方法。本标准适用于转基因抗虫耐除草剂玉米C0030.3.5及其衍生品种，以及制品中C0030.3.5转化体成分的定性PCR检测。x#本应名P0B口SW】2规范性引用文件又注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，录新版包括所有的修改单)通用于GB/T6682分析实验用水规格和试验方法农业部1485号公是0转习因植物及其产品成分枪测DNA级和纯化农业部1861号公告2012转基因植物及其产品成分检测玉米内准基因定性PCR方法农业部2031号公告2013专基因植物及其产品成分检测抽样DNY/T 672转基因植物及其产品检测通用要m3术语和定义刀农业部1861号公
3、暗一2012界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1工C0030.3.5转化体特异性序列event-specific sequenceofC0030.3.5C0030.3.5外源插)片段3端与玉米基因组的连接区序列，包括转化载体A部分序列与玉米基因组部分序列。4原理NT根据转基因抗血耐除划米C608.转化体性于对皮号性，对武样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预的DNA片段，判断样品中是否含有C0030.3.5转亿体成分。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的二级水。5.1琼脂糖。5.210g/L溴化乙锭(EB)溶液：称取1.0g溴化乙锭，溶解于10
4、0mL水中，避光保存。警告溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物。注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。5.310mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。5.4500mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液(pH8.0):称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加人70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(5.3)直至EDTA-Na2完全溶解，用氢氧化钠溶液(5.3)调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min.
5、1农业部2630号公告9-2017按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.4DNA模板制备按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.5PCR扩增7.5.1试样PCR扩增7.5.1.1玉米内标准基因PCR扩增按农业部1861号公告一3一2012中7.5.1.1.1的规定执行。7.5.1.2转化体特异性序列PCR扩增7.5.1.2.1每个试样PCR扩增设置3个平行。7.5.1.2.2在PC管中按表1依次加入反应试剂配制反应体系，混匀，再加25L石蜡油（有热盖功能的PCR仪可不加)。或采用经验证后效果相当的定性PCR试剂盒配制反应体系。表1PCR检测反应体系试剂终浓度体积，Ld
6、dH:O10XPCR缓冲液1X2.525mmol/L氯化镁溶液1.5 mmol/L1.5dNTPs混合溶液0.2 mmol/L2.010mol/LC0030.3.5-F0.4 gmol/L1.010mol/LC0030.3.5-R0.4 umol/L1.0Tag DNA聚合酶0.025U/L25mg/LDNA模板2.0 mg/L2.0总体积25.0“一”表示体积不确定，如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据Taq DNA聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整ddH,0的体积，使反应体系总体积达到25.0L.若采用定性PCR试剂盒，则按试剂盒的推荐用量配制反应体系，但上、下游引物用量按
7、表1执行。7.5.1.2.3将PCR管放在离心机上，500g3000g离心10s,然后取出PCR管，放人PCR仪中。7.5.1.2.4进行PCR扩增。反应程序为：95变性5min;95变性30s,58退火30s,72延伸30s,共进行35次循环；72延伸7min;10保存。7.5.1.2.5反应结束后取出PCR管，对PCR扩增产物进行电泳检测。7.5.2对照PCR扩增在试样PCR扩增的同时，应设置PCR阳性对照、PCR阴性对照和PCR空白对照。以转基因抗虫耐除草剂玉米C0030.3.5为阳性对照（转基因抗虫耐除草剂玉米C0030.3.5的质量分数为0.1%1.0%的玉米基因组DNA,或转基因抗
8、虫耐除草剂玉米C0030.3.5转化体特异性序列与玉米基因组内标准基因相比的拷贝数分数为0.1%1.0%的DNA溶液)；以非转基因玉米基因组DNA为阴性对照；以水为空白对照。除模板外，对照PCR扩增与试样PCR扩增相同(7.5.1)。7.6PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加人1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加人5LEB溶液或适量的其他核酸染料，混匀，稍事冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12LPC产物与3L加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm5V/cm条件下电泳检测。7.7凝胶成像分析
