1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B4 7 8 9.82 0 1 6食品安全国家标准食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验2 0 1 6-0 8-3 1发布2 0 1 7-0 3-0 1实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布G B4 7 8 9.82 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T4 7 8 9.82 0 0 8 食品卫生微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验。本标准与G B/T4 7 8 9.82 0 0 8相比,主要变化如下:标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验”;修改了典型菌落的形态描述;删除了生化鉴定中的商品化名
2、称;描述了血清鉴定的方法。G B4 7 8 9.82 0 1 61 食品安全国家标准食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验1 范围本标准规定了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a)的检验方法。本标准适用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1 冰箱:04。2.2 恒温培养箱:2 61、3 61。2.3 显微镜:1 0倍1 0 0倍。2.4 均质器。2.5 天平:感量0.1g。2.6 灭菌试管:1 6mm1 6 0mm、1 5mm1 0 0mm。2
3、.7 灭菌吸管:1m L(具0.0 1m L刻度)、1 0m L(具0.1m L刻度)。2.8 锥形瓶:2 0 0m L、5 0 0m L。2.9 灭菌平皿:直径9 0mm。2.1 0 微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。3 培养基和试剂3.1 改良磷酸盐缓冲液:见A.1。3.2 C I N-1培养基(C e p u l o d i nI r g a s a nN o v o b i o c i nA g a r):见A.2。3.3 改良Y培养基(A g a rY,M o d i f i e d):见A.3。3.4 改良克氏双糖培养基:见A.4。3.5 糖发酵管:见A.5。3.6 鸟氨酸
4、脱羧酶试验培养基:见A.6。3.7 半固体琼脂:见A.7。3.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水 甲基红(MR)和V-P试验用:见A.8。3.9 碱处理液:见A.9。3.1 0 尿素培养基:见A.1 0。3.1 1 营养琼脂:见A.1 1。3.1 2 小肠结肠炎耶尔森氏菌诊断血清。G B4 7 8 9.82 0 1 62 4 检验程序小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。图1 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序5 操作步骤5.1 增菌以无菌操作取2 5g(或2 5m L)样品放入含有2 2 5m L改良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质杯或均质袋内,以80 0 0r/m i n均质1m i n或拍击式均质器均质1m i
5、 n。液体样品或粉末状样品,应振荡混匀。均质后于2 61增菌4 8h7 2h。增菌时间长短可根据对样品污染程度的估计来确定。5.2 碱处理除乳与乳制品外,其他食品的增菌液0.5m L与碱处理液4.5m L充分混合1 5s。G B4 7 8 9.82 0 1 63 5.3 分离将乳与乳制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种于C I N-1琼脂平板和改良Y琼脂平板,2 61培养4 8h2h。典型菌落在C I N-1上为深红色中心,周围具有无色透明圈(红色牛眼状菌落),菌落大小为1mm2mm,在改良Y琼脂平板上为无色透明、不黏稠的菌落。5.4 改良克氏双糖试验分别挑取5.3中的可疑菌落3个5
6、个,分别接种于改良克氏双糖铁琼脂,接种时先在斜面划线,再于底层穿刺,2 61培养2 4h,将斜面和底部皆变黄且不产气的培养物做进一步的生化鉴定。5.5 尿素酶试验和动力观察用接种环挑取一满环5.4得到的可疑培养物,接种到尿素培养基中,接种量应足够大,振摇几秒钟,2 61培养2h4h。将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中,于2 61和3 61培养2 4h。将在2 6有动力而3 6无动力的可疑菌培养物划线接种营养琼脂平板,进行纯化培养,用纯化物进行革兰氏染色镜检和生化试验。5.6 革兰氏染色镜检将纯化的可疑菌进行革兰染色。小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌,有时呈椭圆或杆状,大小为
7、(0.8m3.0m)0.8m5.7 生化鉴定5.7.1 从5.5中的营养琼脂平板上挑取单个菌落接种生化反应管,生化反应在2 61进行。小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生化特征以及与其他相似菌的区别见表1。表1 小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化性状鉴别表项 目小肠结肠炎耶尔森氏菌Y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a中间型耶尔森氏菌Y e r s i n i ai n t e r m e d i a弗氏耶尔森氏菌Y e r s i n i af r e d e r i k s e n i i克氏耶尔森氏菌Y e r s i n i ak i r s
8、t e n s e n i i假结核耶尔森氏菌Y e r s i n i ap s e u d o t u b e r c u l o s i s鼠疫耶尔森氏菌Y e r s i n i ap e s t i s动力(2 6)+-尿素酶+-V-P试验(2 6)+-鸟氨酸脱羧酶+-蔗糖d+-棉子糖-+-d山梨醇+-甘露醇+鼠李糖-+-+注:+阳性;-阴性;d有不同生化型。5.7.2 如选择微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统,可根据5.6镜检结果,选择革兰阴性球杆菌菌落作为可疑菌落,从5.5所接种的营养琼脂平板上挑取单菌落,使用微生物生化鉴定试剂盒或微生G B4 7 8 9.82 0 1 6
9、4 物生化鉴定系统进行鉴定。5.8 血清型鉴定(选做项目)除进行生化鉴定外,可选择做血清型鉴定。在洁净的载玻片上加一滴O因子血清,将待试培养物混入其内,使成为均一性混浊悬液,将玻片轻轻摇动0.5m i n1m i n,在黑色背景下观察反应。如在2m i n内出现比较明显的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以检查有无自凝现象;具体操作方法可按G B4 7 8 9.4中沙门氏菌O因子血清分型方法进行。6 结果与报告综合以上及生化特征报告结果,报告2 5g(或2 5m L)样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。G B4 7 8 9.82 0 1 65 附 录 A培
10、养基和试剂A.1 改良磷酸盐缓冲液A.1.1 成分磷酸氢二钠 8.2 3g磷酸二氢钠1.2g氯化钠5.0g三号胆盐1.5g山梨醇2 0.0gA.1.2 制法将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中,再加入三号胆盐及山梨醇,溶解后校正p H至7.6,分装试管,于1 2 1高压灭菌1 5m i n,备用。A.2 C I N-1培养基A.2.1 基础培养基:胰胨2 0.0g酵母浸膏2.0g甘露醇2 0.0g氯化钠1.0g去氧胆酸钠2.0g硫酸镁0.0 1g琼脂1 2.0g蒸馏水9 5 0m L校正p H至7.50.1,将基础培养基于1 2 1高压灭菌1 5m i n,备用。A.2.2 I r g a s a n
11、(二氯苯氧氯酚):可用9 5%的乙醇作溶剂,溶解二苯醚,配成0.4%的溶液来替代I r g a s a n,待基础培养基冷至8 0时,加入1m L混匀。A.2.3 冷至5 0时,加入:中性红(3.0m g/m L)1 0.0m L结晶紫(0.1m g/m L)1 0.0m L头孢菌素(1.5m g/m L)1 0.0m L新生霉素(0.2 5m g/m L)1 0.0m L最后不断搅拌加入1 0.0m L的1 0%氯化锶,倾注平皿。G B4 7 8 9.82 0 1 66 A.3 改良Y培养基A.3.1 成分蛋白胨1 5.0g氯化钠5.0g乳糖1 0.0g草酸钠2.0g去氧胆酸钠6.0g三号胆
12、盐5.0g丙酮酸钠2.0g孟加拉红4 0.0m g水解酪蛋白5.0g琼脂1 7.0g蒸馏水10 0 0m LA.3.2 制法将A.3.1中成分混合,校正p H至7.40.1。于1 2 1高压灭菌1 5m i n,待冷至4 5左右时,倾注平皿。A.4 改良克氏双糖培养基A.4.1 成分蛋白胨2 0.0g牛肉膏3.0g酵母膏3.0g山梨醇2 0.0g葡萄糖1.0g氯化钠5.0g柠檬酸铁铵0.5g硫代硫酸钠0.5g琼脂1 2.0g酚红0.0 2 5g蒸馏水10 0 0m LA.4.2 制法将酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中,校正p H至7.4。加入0.2%的酚红溶液1 2.5m L,摇匀,分装试管,装
13、量宜多些,以便得到比较高的底层。1 2 1高压灭菌1 5m i n,放置高层斜面备用。A.5 糖发酵管A.5.1 成分牛肉膏5.0gG B4 7 8 9.82 0 1 67 蛋白胨1 0.0g氯化钠3.0g磷酸氢二钠2.0g0.2%溴麝香草酚蓝溶液1 2.0m L蒸馏水10 0 0m LA.5.2 制法A.5.2.1 葡萄糖发酵管按A.5.1中成分配好后,校正p H至7.4,按0.5%加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内,1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.5.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶1 0 0m L,1 2 1高压灭菌1 5m i n。另将各种糖类分别配
14、好1 0%溶液,同时高压灭菌。将5m L糖溶液加入1 0 0m L培养基内,以无菌操作分装小试管。蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。A.5.3 试验方法从琼脂斜面上挑取少量培养物接种于2 6 1 培养,一般观察2d3d。迟缓反应需观察1 4d 3 0d。A.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基A.6.1 成分蛋白胨5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g蒸馏水1 0 0 0m L1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0m LL-鸟氨酸或D L-鸟氨酸0.5g/1 0 0m L或1g/1 0 0m LA.6.2 制法除鸟氨酸以外的成分加热溶解后,分装,每瓶1 0 0m L,分别加入鸟氨酸。L-鸟氨酸按
15、0.5%加入,D L-鸟氨酸按1%加入。再校正p H至6.8。对照培养基不加鸟氨酸。分装于无菌的小试管内,每管0.5m L,上面滴加一层液体石蜡,1 1 5高压灭菌1 0m i n。A.6.3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种,于2 61培养1 8h2 4h,观察结果。鸟氨酸脱羧酶阳性者由于产碱,培养基呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管为黄色。A.7 半固体琼脂A.7.1 成分蛋白胨1.0g牛肉膏0.3g氯化钠0.5gG B4 7 8 9.82 0 1 68 琼脂0.3 5g 0.4g蒸馏水1 0 0m LA.7.2 制法将A.7.1中成分配好,煮沸使溶解,并
16、校正p H至7.4。分装小试管,1 2 1 高压灭菌1 5m i n,直立凝固备用。注:供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。A.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水 甲基红(MR)和V-P试验用A.8.1 成分磷酸氢二钾5.0g多胨7.0g葡萄糖5.0g蒸馏水10 0 0m LA.8.2 制法溶化后校正p H至7.0,分装试管,每管1m L,1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.8.3 甲基红(MR)试验自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中,于2 6 1 培养2d5d,哈夫尼亚菌则应在2 22 5培养。滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果。鲜红色为阳性,黄色为阴性。甲基红试剂配法:1 0m g甲基红溶于3 0m L9 5%乙醇中,然后加入2 0m L蒸馏水。A.8.4 V-P试验用琼脂培养物接种本培养基中,于2 61培养2d 4d。哈夫尼亚菌则应在2 22 5培养。加入6%-萘酚-乙醇溶液0.5m L和4 0%氢氧化钾溶液0.2m L,充分振摇试管,观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在3 61培养4h再进行观察。A.9 碱处理液A.9.1 0.5%氯化钠溶液氯化钠0
