1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B4 7 8 9.1 02 0 1 6食品安全国家标准食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验2 0 1 6-1 2-2 3发布2 0 1 7-0 6-2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B4 7 8 9.1 02 0 1 6 前 言 本标准代替G B4 7 8 9.1 02 0 1 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验、S N/T0 1 7 22 0 1 0 进出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法、S N/T2 1 5 42 0 0 8 进出口食品中凝固酶阳性葡萄球
2、菌检测方法 兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术。本标准与G B4 7 8 9.1 02 0 1 0相比,主要变化如下:试验用增菌液统一为7.5%氯化钠肉汤。G B4 7 8 9.1 02 0 1 61 食品安全国家标准食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验1 范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u sa u r e u s)的检验方法。本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品中金黄色葡萄球菌的计数。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培
3、养设备外,其他设备和材料如下:2.1 恒温培养箱:3 61。2.2 冰箱:25。2.3 恒温水浴箱:3 65 6。2.4 天平:感量0.1g。2.5 均质器。2.6 振荡器。2.7 无菌吸管:1m L(具0.0 1m L刻度)、1 0m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头。2.8 无菌锥形瓶:容量1 0 0m L、5 0 0m L。2.9 无菌培养皿:直径9 0mm。2.1 0 涂布棒。2.1 1 p H计或p H比色管或精密p H试纸。3 培养基和试剂3.1 7.5%氯化钠肉汤:见A.1。3.2 血琼脂平板:见A.2。3.3 B a i r d-P a r k e r琼脂平板:见A.
4、3。3.4 脑心浸出液肉汤(B H I):见A.4。3.5 兔血浆:见A.5。3.6 稀释液:磷酸盐缓冲液:见A.6。3.7 营养琼脂小斜面:见A.7。3.8 革兰氏染色液:见A.8。3.9 无菌生理盐水:见A.9。第一法 金黄色葡萄球菌定性检验4 检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。G B4 7 8 9.1 02 0 1 62 图1 金黄色葡萄球菌检验程序5 操作步骤5.1 样品的处理称取2 5g样品至盛有2 2 5m L7.5%氯化钠肉汤的无菌均质杯内,80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i n均质1m i n 2m i n,或放入盛有2 2 5m L7.5%氯化钠肉
5、汤无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n2m i n。若样品为液态,吸取2 5m L样品至盛有2 2 5m L7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀。5.2 增菌将上述样品匀液于3 61培养1 8h2 4h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。5.3 分离将增菌后的培养物,分别划线接种到B a i r d-P a r k e r平板和血平板,血平板3 61培养1 8h2 4h。B a i r d-P a r k e r平板3 61培养2 4h4 8h。5.4 初步鉴定金黄色葡萄球菌在B a i r d-P a r k e r平板上呈圆形,
6、表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白G B4 7 8 9.1 02 0 1 63 色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。5.5 确证鉴定5.5.1 染色镜检:金黄色葡萄球菌为革
7、兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5m1m。5.5.2 血浆凝固酶试验:挑取B a i r d-P a r k e r平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选),分别接种到5m LB H I和营养琼脂小斜面,3 61培养1 8h2 4h。取新鲜配制兔血浆0.5m L,放入小试管中,再加入B H I培养物0.2m L0.3m L,振荡摇匀,置3 61温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说
8、明书操作,进行血浆凝固酶试验。结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5m LB H I,3 61培养1 8h4 8h,重复试验。5.6 葡萄球菌肠毒素的检验(选做)可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,应按附录B检测葡萄球菌肠毒素。6 结果与报告6.1 结果判定:符合5.4、5.5,可判定为金黄色葡萄球菌。6.2 结果报告:在2 5g(m L)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。第二法 金黄色葡萄球菌平板计数法7 检验程序金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序见图2。图2 金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序G B4 7 8 9.1 02 0 1 64 8 操作步骤8.1 样品的
9、稀释8.1.1 固体和半固体样品:称取2 5g样品置于盛有2 2 5m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i n均质1m i n2m i n,或置于盛有2 2 5m L稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n 2m i n,制成11 0的样品匀液。8.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取2 5m L样品置于盛有2 2 5m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成11 0的样品匀液。8.1.3 用1m L无菌吸管或微量移液器吸取11 0样品匀液1m L,沿管壁缓慢注于盛有9m L磷酸
10、盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1m L无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成11 0 0的样品匀液。8.1.4 按8.1.3操作程序,制备1 0倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1m L无菌吸管或吸头。8.2 样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行1 0倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1m L样品匀液以0.3m L、0.3m L、0.4m L接种量分别加入三块B a i r d-P a r k e r平板,然后用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如
11、B a i r d-P a r k e r平板表面有水珠,可放在2 55 0的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。8.3 培养在通常情况下,涂布后,将平板静置1 0m i n,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱3 61培养1h;等样品匀液吸收后翻转平板,倒置后于3 61培养2 4h4 8h。8.4 典型菌落计数和确认8.4.1 金黄色葡萄球菌在B a i r d-P a r k e r平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2 mm3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不
12、分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。8.4.2 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在2 0C F U2 0 0C F U之间的平板,计数典型菌落数。8.4.3 从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验。分别做染色镜检,血浆凝固酶试验(见5.5);同时划线接种到血平板3 61培养1 8h2 4h后观察菌落形态,金黄色葡萄球菌菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。9 结果计算9.1
13、若只有一个稀释度平板的典型菌落数在2 0C F U2 0 0C F U之间,计数该稀释度平板上的典型菌G B4 7 8 9.1 02 0 1 65 落,按式(1)计算。9.2 若最低稀释度平板的典型菌落数小于2 0C F U,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。9.3 若某一稀释度平板的典型菌落数大于2 0 0C F U,但下一稀释度平板上没有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。9.4 若某一稀释度平板的典型菌落数大于2 0 0C F U,而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在2 0C F U2 0 0C F U范围内,应计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算
14、。9.5 若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在2 0C F U2 0 0C F U之间,按式(2)计算。9.6 计算公式式(1):T=A BC d(1)式中:T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A 某一稀释度典型菌落的总数;B 某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;C 某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;d 稀释因子。式(2):T=A1B1/C1+A2B2/C21.1d(2)式中:T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A1 第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B1 第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C1 第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;A2 第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B2
15、第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C2 第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;1.1 计算系数;d 稀释因子(第一稀释度)。1 0 报告根据9中公式计算结果,报告每g(m L)样品中金黄色葡萄球菌数,以C F U/g(m L)表示;如T值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。第三法 金黄色葡萄球菌MP N计数1 1 检验程序金黄色葡萄球菌MP N计数检验程序见图3。G B4 7 8 9.1 02 0 1 66 图3 金黄色葡萄球菌MP N法检验程序1 2 操作步骤1 2.1 样品的稀释按8.1进行。1 2.2 接种和培养1 2.2.1 根据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀
16、释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行1 0倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种1 m L样品匀液至7.5%氯化钠肉汤管(如接种量超过1m L,则用双料7.5%氯化钠肉汤),每个稀释度接种3管,将上述接种物3 61培养,1 8h2 4h。1 2.2.2 用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环,移种于B a i r d-P a r k e r平板3 61培养,2 4h4 8h。1 2.3 典型菌落确认按8.4.1、8.4.3进行。1 3 结果与报告根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数,查MP N检索表(见附录C),报告每g(m L)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数,以MP N/g(m L)表示。G B4 7 8 9.1 02 0 1 67 附 录 A培养基和试剂A.1 7.5%氯化钠肉汤A.1.1 成分蛋白胨 1 0.0g牛肉膏 5.0g氯化钠 7 5g蒸馏水 10 0 0m LA.1.2 制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.40.2,分装,每瓶2 2 5m L,1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.2 血琼脂平板A.2.1 成分豆粉琼脂(p H7.50.2
