1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 4 1 3.4 02 0 1 6食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定2 0 1 6-0 8-3 1发布2 0 1 7-0 3-0 1实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布G B5 4 1 3.4 02 0 1 61 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定1 范围本标准规定了液相色谱法测定游离核苷酸总量的方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中游离核苷酸总量(包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸)的测定。2 原理试样经过水提取,用沉淀剂沉淀蛋白质后,通过高效液相色谱分离,用紫外检测器
2、外标法测定试样中核苷酸的含量。3 试剂与材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6 6 8 2规定的三级水,液相色谱流动相用水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 淀粉酶:酶活力1.5U/m g。3.1.2 冰乙酸(CH3C OOH)。3.1.3 四丁基硫酸氢铵(C4H9)4NH S O4。3.1.4 甲醇(CH3OH)。3.1.5 磷酸氢二钾(K2H P O4)。3.1.6 磷酸二氢钾(KH2P O4)。3.1.7 磷酸(H3P O4)。3.2 试剂配制3.2.1 乙酸溶液(1 0 0m L/L):吸取1 0m L冰乙酸,加水定容到1 0 0m L
3、。3.2.2 磷酸氢二钾溶液(0.1m o l/L):称取2.2 8g磷酸氢二钾,用超纯水溶解并定容到1 0 0m L。3.2.3 磷酸盐缓冲液(1.4 0mm o l/L四丁基硫酸氢铵,0.0 1m o l/L磷酸二氢钾):称取1.3 6 0g磷酸二氢钾,加0.4 7 53g四丁基硫酸氢铵,加9 0 0m L水溶解,用磷酸氢二钾溶液调p H至3.2,用水定容到10 0 0m L。一周内使用。3.3 核苷酸标准品3.3.1 胞嘧啶核苷酸(CMP)(C9H1 4N3O8P):纯度9 9%。3.3.2 腺嘌呤核苷酸(AMP)(C1 0H1 4N5O7P):纯度9 9%。3.3.3 尿嘧啶核苷酸(U
4、MP)(C9H1 3N2O9P):纯度9 9%。G B5 4 1 3.4 02 0 1 62 3.3.4 鸟嘌呤核苷酸(GMP)(C1 0H1 4N5O8P):纯度9 9%。3.3.5 次黄嘌呤核苷酸(I MP)(C1 0H1 3N4O8P):纯度9 9%。3.4 标准溶液配制核苷酸标准混合液(应当天配置):分别称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP各1 0m g、GMP和I MP各5m g(准确至0.1m g),用超纯水溶解转移至同一个1 0 0m L容量瓶中,用水定容至1 0 0m L。此标准溶液浓度为:CMP、AMP、UMP各1 0 0g/m L;GMP、I MP各5 0g/m L。每个
5、组分称取的质量都要校正水分和钠盐含量,以酸型计。4 仪器与设备4.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。4.2 天平:感量0.1m g。4.3 p H计:精度0.0 1。4.4 恒温培养箱:2。5 分析步骤5.1 试样制备5.1.1 样品预处理5.1.1.1 含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约5g(精确至0.1m g),于1 0 0m L锥形瓶中,加入约0.2g淀粉酶,加入2 0m L热水(3 04 0)充分溶解试样,或称取混合均匀的液体试样约2 0g(精确至1m g)于1 0 0m L锥形瓶中,加入约0.2g淀粉酶摇匀,于3 72培养箱内酶解3 0m i n。取出冷却至室温
6、。5.1.1.2 不含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约5g(精确至0.1m g),于1 0 0m L锥形瓶中,加入2 0m L热水(5 06 0)充分溶解试样,冷却至室温,或称取混合均匀的液体试样约2 0g(精确至1m g)于1 0 0m L锥形瓶中。5.1.2 待测液的制备用醋酸溶液调试样溶液p H4.1,移入5 0m L容量瓶中,定容,滤纸过滤,所得滤液用0.4 5m微膜过滤备用。5.2 参考色谱条件5.2.1 流动相:磷酸盐缓冲液+甲醇=10 0 0+4 0。5.2.2 色谱柱:C1 8-T反相色谱柱(2 5 0mm4.6mm,5m)或具同等性能的色谱柱。5.2.3 流速:1m L/m
7、 i n。5.2.4 波长:2 5 4n m。5.2.5 柱温:2 5。5.2.6 进样体积:1 0L。注:必要时可以用磷酸或磷酸氢二钾溶液适当调流动相的p H至分离情况最佳。G B5 4 1 3.4 02 0 1 63 5.3 标准曲线绘制分别吸取标准混合溶液2m L、4m L、6m L、8m L、1 0m L,加超纯水定容至5 0m L,配成核苷酸系列标准工作液,见表1。表1 核苷酸系列标准工作液各组分浓度单位为微克每毫升序号CMPAMPUMPGMPI MP14442228884431 21 21 26641 61 61 68852 02 02 01 01 0 将上核苷酸系列标准工作液分别
8、注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积或峰高。以峰面积或峰高为纵坐标,以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线。5.4 试样溶液的测定将制备好的试样溶液注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积或峰高。根据标准曲线得到待测液中核苷酸的浓度(g/m L)。6 分析结果的表述6.1 结果计算试样中游离核苷酸各组分的含量Xi(CMP、UMP、GMP、I MP、AMP)按式(1)计算:Xi=CiVinmi10 0 01 0 0(1)式中:Xi 试样中核苷酸各组分的含量(分别是:XCMP、XUMP、XGMP、XI MP、XAMP),单位为毫克每百克(m g/1 0 0g);Ci 试样溶液中核苷酸各组分的浓度,单
9、位为微克每毫升(g/m L);Vi 试样溶液的体积,单位为毫升(m L);n 样液稀释倍数;mi 试样的质量,单位为克(g)。试样中游离核苷酸的总量按式(2)计算:X总=Xi=XCMP+XAMP+XUMP+XGMP+XI MP(2)式中:X总 试样中游离核苷酸的总量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0g);XCMP 按式(1)计算出的游离胞嘧啶核苷酸含量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0g);XAMP 按式(1)计算出的游离腺嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0g);XUMP 按式(1)计算出的游离尿嘧啶核苷酸含量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0g);XGMP 按式
10、(1)计算出的游离鸟嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0g);XI MP 按式(1)计算出的游离次黄嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(m g/1 0 0g)。G B5 4 1 3.4 02 0 1 64 6.2 结果表示计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留到小数点后两位。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 0%。8 其他高效液相色谱紫外法标准和试样核苷酸色谱图见附录A。本标核苷酸各组分定量限分别为:CMP 定量限为 3.3m g/k g。AMP定量限为5.0m g/k g。UMP定量限为5.0m g/k g。GMP定量限为5.0m g/k g。I MP定量限为6.7m g/k g。G B5 4 1 3.4 02 0 1 65 附 录 A核苷酸标准品和试样高效液相色谱图A.1 核苷酸标准品色谱图核苷酸标准品色谱图见图A.1。图A.1 核苷酸标准品色谱图A.2 样品色谱图样品色谱图见图A.2。图A.2 样品色谱图
