1、GB/T14700-2018前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替GB/T14700-2002饲料中维生素B1的测定。本标准与GB/T14700-2002相比，主要技术变化如下：修改了适用范围（见第1章，2002年版的第1章）；删去了硫胺素的分子式（见第3章，2002年版的3.1）；酸性20%乙醇溶液的制备给出具体配置过程（见第3章，2002年版的3.2）；样品制备中规定添加剂预混合饲料不粉碎（见第4章，2002年版的4.4）；复合预混合饲料提取液区别于维生素预混合饲料，改为酸性氯化铵甲醇溶液（见第4章，2002年版的4.2.9)；增加了维生素B1的色谱图和光谱图（见
2、附录A)。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心(北京)。本标准主要起草人：李兰、贾铮、樊霞。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T14700-1999、GB/T14700-2002。IGB/T14700-2018饲料中维生素B1的测定1范围本标准规定了用荧光分光光度法和高效液相色谱法测定饲料中维生素B含量的两种方法。本标准方法1适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中的维生素B1的测定。方法的定量限为1mg/kg(在有吸附硫胺素或影响硫色素荧光干扰物质存在的情况，本方法不适用)
3、。该方法所测定的维生素B1包括内源性以及添加量总和。本标准规定的方法2适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料的测定。方法2的检出限为3mg/kg;定量限为15 mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备3方法1：荧光分光光度法3.1原理试样中的维生素B:经稀酸以及消化酶分解、吸附剂的吸附分离提纯后，在碱性条件下被铁氰化钾氧化生成荧光色素-硫色素，
4、用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的荧光强度与试样中维生素B1的含量成正比，依此进行定量测定。3.2试剂或溶液除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，色谱用水应满足GB/T6682中一级水的要求；实验用水应满足GB/T6682中三级水的要求。3.2.1盐酸溶液c(HCl)=0.1mol/L。3.2.2硫酸溶液c(1/2H2SO4)=0.05mol/L。3.2.3乙酸钠溶液c(CHCOONa)=2.0 mol/L。3.2.4100g/L淀粉酶悬乳液：用乙酸钠溶液(3.2.3)悬浮10g淀粉酶制剂，稀释至100mL,使用当日制备。3.2.5氯化钾溶液：250g/L。3.2.6酸性氯化钾溶液：将8.5m
5、L浓盐酸加入至氯化钾溶液(3.2.5)中，并稀释至1000mL。3.2.7氢氧化钠溶液：150g/L。3.2.8铁氰化钾溶液：10g/L。3.2.9碱性铁氰化钾溶液：移取4.00mL的铁氰化钾溶液(3.2.8)与氢氧化钠溶液(3.2.7)混合使之成100mL,此液4h内使用。1GB/T14700-20183.2.10冰乙酸溶液：30mL/L。3.2.11酸性20%乙醇溶液：取80mL水，用盐酸溶液(3.2.1)调节pH3.54.3,与20mL无水乙醇混合。3.2.12人造沸石0.25mm0.18mm(60目80目)：使用前应活化，方法如下：将适量人造沸石置于大烧杯中，加入10倍容积，加热到60
6、C70的冰乙酸溶液(3.2.10)，用玻璃棒均匀搅动10min,使沸石在冰乙酸溶液中悬浮，待沸石沉降后，弃去上层冰乙酸液，重复上述操作2次。换用5倍容积，加热到60C70C的氯化钾溶液(3.2.5)搅动清洗2次，每次15min。再用热冰乙酸溶液洗10min。最后用热水清洗沸石至无氯离子（用10g/L硝酸银水溶液检验）。用布氏漏斗抽滤，105烘干，贮于磨口瓶可使用6个月。使用前，检查沸石对维生素B1标准溶液的回收率，如达不到92%，应重新活化沸石。注：沸石对维生素B1回收率的检查：移取维生素B标准中间液(3.2.13.2)2mL用酸性氯化钾溶液(3.2.6)定容至100mL。按照3.5.4.13
7、.5.4.3步骤进行氧化，作为外标。另一份维生素B标准工作液(3.2.13.3)移取25mL重复3.5.3.13.5.3.3过柱操作，按照3.5.4.13.5.4.3步骤进行氧化。同时测定两份溶液荧光强度，依照式(1)计算，经换算为百分数就是沸石对维生素B1的回收率值。3.2.13维生素B标准溶液3.2.13.1维生素B标准贮备液：取硝酸硫胺素标准品（纯度大于99%），于五氧化二磷干燥器中干燥24h。称取0.01g(精确至0.0001g),溶解于酸性20%乙醇溶液(3.2.11)中并定容至100mL,盛于棕色瓶中，2C8C冰箱保存，可使用3个月。该溶液含0.1mg/mL维生素B.。3.2.13
8、.2维生素B1标准中液：取维生素B.标准购备液(3.2.13.1)10 mL用酸性20%乙醇溶液(3.2.11)定容至100mL,盛于棕色瓶中2C8C冰箱保存，可使用48h.该溶液含10g/mL维生素B1。3.2.13.3维生素B1标准工作液：取维生素B标准中液(3.2.13.2)2mL与65mL盐酸溶液(3.2.1)和5mL乙酸钠溶液(3.2.3)混合，定容至100mL,分析前制备。该溶液含0.2g/mL维生素B1。3.2.14硫酸奎宁溶液3.2.14.1硫酸宁贮备液：称取硫酸宁0.1g(精确至0.001g),用硫酸溶液(3.2.2)溶解并定容至1000mL。贮于棕色瓶中，冷藏。若溶液混浊则
9、需要重新配制3.2.14.2硫酸奎宁工作液：取贮备液(3.2.13.)3mL,硫酸溶液(3.2.2)定容至1000mL。贮于棕色瓶中，冷藏。该溶液含0.3g/mL硫酸奎宁。3.2.15正丁醇：荧光强度不超过硫酸奎宁工作液(3.2.14.2)的4%，否则需用全玻璃蒸馏器重蒸馏，取114C118C馏分3.3仪器设备3.3.1实验室常用玻璃器皿。3.3.2分析天平：感量0.0001g,0.001g。3.3.3高压釜，使用温度为121C123C或压力达到15kg/cm23.3.4电热恒温箱，45C50。3.3.5吸附分离柱：全长235mm,外径长度如下：上端贮液槽尺寸为35mm70mm,容量约为50m
10、L,中部吸附管8mm130mm;下端35mm拉成毛细管。3.3.6具塞离心管25mL。3.3.7荧光分光光度计，备1cm石英比色杯。3.3.8注射器：10mL。3.4样品按照GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按GB/T20195制备试样，粉2GB/T14700-2018碎过0.425mm孔径筛，充分混匀。3.5试验步骤3.5.1称样称取原料、配合饲料、浓缩饲料1g2g,精确至0.001g,置于100mL棕色锥形瓶中。3.5.2试样溶液的制备3.5.2.1水解：加入盐酸溶液(3.2.1)65mL于锥形瓶中，加塞后置于沸水浴加热30min或于高压釜(3.3.2)中加热
11、30min,开始加热5min10min内不时摇动锥形瓶，以防结块。3.5.2.2酶解：冷却锥形瓶至50C以下，加5mL淀粉酶悬浮液(3.2.4)，摇匀。该溶液pH约为4.04.5,将锥形瓶至于电热恒温箱(3.3.4)中45C50保温31.取出冷却，用盐酸溶液(3.2.1)调整pH至3.5，转移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至100mL,摇匀。3.5.2.3过滤：将全部试液通过无灰滤纸过滤，弃去初滤液5mL,收集滤液作为试样溶液。3.5.3试样溶液的纯化3.5.3.1制备吸附柱：称取1.5g活化人造沸石(3.2.12)置于50mL小烧杯中，加入3%冰乙酸溶液(3.2.10)浸泡，溶液液面没过
12、沸石即可。将脱脂棉置于吸附分离柱(3.3.5)底部，用玻璃棒轻压。然后将乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中（勿使吸附柱脱水），过柱流速控制在1mL/mn为宜。再用10mL近沸的水洗柱1次。3.5.3.2吸取25mL试样溶液(3.5.2.3)，慢慢加人制备好的吸附柱中，弃去滤液，用每份5mL近沸的水洗柱3次，弃去洗液。同时做平行样。3.5.3.3用25mL60C70C酸性氯化钾溶液(3.2.6)分3次连续加入吸附柱，收集洗脱液于25mL容量瓶中，冷却后用酸性氯化钾溶液定容，混匀。3.5.3.4同时用25mL维生素B.标准工作液(3.2.13.3)重复3.5.3.13.5.3.3操作，作为外标。3.5.4
13、氧化与萃取警示以下操作避光进行。3.5.4.1于2只具塞离心管(3.3.6)中各吸人5mL洗脱液(3.5.3.3)，分别标记为A、B。3.5.4.2在B管加入3mL氢氧化钠溶液(3.2.7)，再向A管中加3mL碱性铁氰化钾溶液(3.2.9)，轻轻旋摇。依次立即向A管加入15mL正丁醇(3.2.15)加塞，剧烈振摇15s,再向B管加入15mL正丁醇加塞，共同振摇90s,静置分层。3.5.4.3用注射器(3.3.8)吸去下层水相，向各反应管加人约2g无水硫酸钠，旋摇，待测。3.5.4.4同时将5mL作为外标的洗脱液(3.5.3.4)，置人另2只具塞离心管，分别标记为C、D,按3.5.4.13.5.4.3操作。3.5.5测定3.5.5.1用硫酸奎宁工作液(3.2.14.2)调整荧光仪，使其固定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。3.5.5.2于激发波长365nm,发射波长435nm处测定A管、B管、C管、D管中萃取液的荧光强度。3.6试验数据处理本方法测定的维生素B1以硝酸硫胺素计，如需要以盐酸硫胺素计，按1mg盐酸硫胺素含1.03mg硝酸硫胺素换算。3
