1、G B/T 1 4 9 2 4.1 1 一2 0 0 1前言本标准的全部技术内容为推荐性的。本标准从G B 1 4 9 2 4-1 9 9 4 实验动物全价营养饲料 中分离出来，形成独立的标准。本标准中所列两种方法具有同等效力。本标准及其配套标准自 实施之日 起，代替G B 1 4 9 2 4-1 9 9 4,本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:周瑞华、王竹、石磊、王光亚、张瑜、郑陶、刘秀梅。本标准由国家科学技术部委托技术归口 单位中国实验动物学会负责解释。本标准于1 9 9 4 年1 月首次发布。中华 人 民 共 和 国 国 家 标
2、 准实验动物配合饲料维生素的测定G B/T 1 4 9 2 41 1-2 0 0 1L a b o r a t o r y a n i ma l s-F o r mu l a f e e d s代替 G B 1 4 9 2 4 1 9 9 1-De t e r mi n a t i o n o f v i t a mi n s范 围本标准规定了实验动物配合饲料中维生素的测定方法，即配合饲料中维生素A、维生素E,B,、维生素B,D、的侧定方法烟酸、维生素 B fi、总抗坏血酸、总胆碱、叶酸、维生素 B,、维生素 K3、泛酸、生物素、维生素维生素本标准适用于实验动物小鼠、大鼠、兔、豚鼠、地鼠、犬和
3、猴的配合饲料及其原料的测定。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准时的各方应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。G B/T 1 2 3 8 8-1 9 9。食物中维生素A和维生素E的测定方法G B/T 1 2 3 9 0-1 9 9。食物中硫胺素(维生素B,)的测定方法G B/T 1 2 3 9 1-1 9 9 0 食物中核黄素的测定方法G B/T 1 2 3 9 2-1 9 9 0 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法荧光法和2,4 一 二硝基苯胺法G B/T 1 2 3 9 5-1 9 9
4、 0 食物中烟酸的测定方法G B/T 1 4 7 0 0-1 9 9 3 饲料中维生素B,测定方法G B/T 1 4 7 0 1-1 9 9 3 饲料中维生素B z 测定方法G B/T 1 7 4 0 7-1 9 9 8 食物中 维生素B。的测定G B/T 1 7 8 1 2-1 9 9 9 饲料中维生素E的测定高效液相色谱法G B/T 1 7 8 1 6-1 9 9 9 饲料中总抗坏血酸的测定邻苯二胺荧光法G B/T 1 7 8 1 7-1 9 9 9 饲料中维生素A的测定高效液相色谱法G 1 3/T 1 7 8 1 8-1 9 9 9 饲料中维生素D:的测定高效液相色谱法3 测定方法11
5、配合饲料中维生素A和维生素E的测定 按G B/T 1 2 3 8 8,G B/T 1 7 8 1 2,G B/T 1 7 8 1 7 的规定执行3.2 配合饲料中维生素B:的测定 按G B/T 1 4 7 0 0,G B/T 1 2 3 9 0 的规定执行。13 配合饲料中维生素B:的测定 按G B/T 1 2 3 9 1,G B/T 1 4 7 0 1 的规定执行。中华人民共和国国家质It监督检验检疫总局2 0 0 1-0 8-2 9 批准2 0 0 2-0 5-0 1实施G B/T 1 4 9 2 41 1 2 0 0 134 酉 己 合饲料中烟酸的测定 按G B/T 1 2 3 9 5
6、规定执行35 配合饲料中维生素B。的测定 按(=B/r 1 7 3 0 7 规定执行。I6 配合饲料中总杭坏血酸的测定 按G B/r 1 2 3 9 2,G B/T 1 7 8 1 6 规定执行I了 配合饲料中总胆碱的测定3.7.1 原理 配合饲料中的胆碱经过碱处理提取后，通过硅镁吸附3i(J 柱色谱纯化.然后用雷纳克盐(r e i n e c k a t e)I胆碱反应生成粉红色的胆碱一 雷纳克盐复合物。此复合物被丙酮洗脱后，在 5 2 6 n m有最大吸收 其吸收伎与胆碱浓度成正比。本方法检出限为。.1 m g3了.2 试剂 所有试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。17.2.1 甲醇3.7-
7、2.2 三氯甲烷。3.7-2.3 乙酸甲醋。17.2.4 丙酮。I了.2.5 1 0%丙酮 取 1 0 m l，丙酮与9 0 m l，水混合。17.2.6 冰乙酸。3.7-2.了 冰乙酸一 甲醇溶液:取 l o m 工冰乙酸和9 0 m l甲醇混合。3.7.2.8 氢氧化钡。3-7.29 硅镁吸附剂(F l o r i s i l):6 0 -1 0 0 目。17.2.1 0 提取液:于1 0 0 m l甲醇中加人4-5 g 无水氢氧化钡，搅拌1 0 m i n 再加人l o m 工只氯甲烷混合 过滤去除多余的氢氧化钡。3.7-2.1 1 雷纳克馁盐(a m m o n i u m r e i
8、 n e c k a t e)饱和溶液:称取2 3 g 雷纳克钱盐，加人 l o o m l 水，搅拌 1 0 m i n，过滤去除多余的雷纳克钱盐。实验当日 配制。17.2.1 2 胆碱标准贮备液(5 m g/m L):准确称取无水氯化胆碱0.5 7 61 g.溶解于水中.并定容至1 0 0 m l。冰箱保存。3.7-2.1 3 胆碱标准应用液(1.0 m g/m L):准确吸取2 0.0 m 工标准贮备液，用水稀释并定容至1 0 0 m 工 J17.3 仪器与设备3.7.3.1 实验室常用设备。3.7.3.2 回流提取装置。3.7.3.3 色谱柱:0.8 c m(内径)X 3 0 c m的
9、玻璃柱，柱上端为容积 3 0-5 0 m L的储液杯，底端收缩变细，并装有活塞活塞上约 1 c m处有一玻璃筛板，筛板孔径为 1 6 3 0 p m。使用前需干燥3.7-3.4 分光光度计3-7.4 测定步骤 3.7.41 提取 称取适量样品(约含 5 5 0 m g胆碱)，置干 1 0 0 m L具塞锥型瓶中，加人4 0 m l提取液、于7 6-8 2 C 恒温水浴回流 3h，回流速度为每秒 1-2 滴。冷却，样品过滤至 1 0 0 m 容量瓶中，反复用 5-1 0 mI.冰乙酸一 甲醇溶液洗涤锥形瓶和滤渣，洗液并人容量瓶中，用冰乙酸调节p H至 2-6,用甲醇定容 至刻度 3.7.4.2
10、纯化 3.7.4.2 门填装色谱柱:将干燥的硅镁吸附剂约4 g 浸人甲醇中，取干燥色谱柱，湿法将硅镁吸附剂填G s/T 1 4 9 2 4,1 1-2 0 0 1充人色潜柱中，至硅镁吸附剂的高度达 1 0 c m左右。用甲醇冲洗色谱柱 并保持甲醇液面高于硅镁吸附4 1 1-2 c m，直至使用为止3.7.4.2.2 柱色谱纯化:吸取 5 0 m工的提取液，加到已填装好的色谱柱中，打开底端活塞，使提取液靠重力作用流过色谱柱 立即依次用5,1 0 m L甲醇,2 份1 0 m l乙酸甲醋和1 0 m 1.1 0%丙酮洗涤色谱柱接着加人5 mL雷纳克钱盐饱和溶液通过色谱柱，用 2 份 1 0 m l
11、冰乙酸洗涤，直至流出液清亮为止。少 月1 5 m l丙酮洗脱色谱柱上胆碱一 雷纳克盐复合物的粉红色色谱带，用 2 5 m l-具塞量筒收集全部洗脱液并用丙酮定容至1 5 m 工。3.了4.3 比色测定:用分光光度计，于 5 2 6 n m波长下。以丙酮调节零点、测定样品吸光度值，在标币工作曲线上查出胆碱含量，或用回归方程计算出相应的胆碱含量，求得计算结果。3.7-4.4 标准工作曲线:分别吸取 0.5 0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL标准应用液，相当于胆碱含量 0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 m g，按照上述样品测定步骤操作。以 胆碱含量做横坐标，以吸光度值为纵
12、坐标绘制标准工作曲线，并计算回归方程。I7.5 计算结果 见式(1)ec xm xV,Vx 1 0 0.，(1)式中:X-一 样品中胆碱的含量,m g/1 0 0 g;。从标准回归曲线上查得的胆碱含量,m g;V样品提取液定容体积，mL;V z 一 纯化用提取液的体积，mL;M-样品质量，9。I了6 结果的允许差 同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值1 0%3.8 配合饲料中叶酸的v 9 定微生物法3.8.1 原理 叶酸是干酪乳酸杆菌(L a c t o b a c i l l u s c a s e i,L.C,A T C C 7 4 6 9)生长所必需的营养素。在一定条件下L.
13、C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖强度用测定吸光度值表示。与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。本方法检出限为。.1 n g o3.8-2 试剂 本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度除特别注明外均为分析纯。3.8-2.1 甲苯。3.8-2.2 生理盐水:使用前需灭菌处理。38.2,3 菌种:干酪乳酸杆菌(L a c t o b a ci l l u s c a s e i,L.CA T C C 7 4 6 9)3.8-2.4 磷酸缓冲液(0.0 5 m o l/Lp H 6.8):称取4.3 5 g 磷酸钠(N a,P O,1 2 H 2 0),1 0.3 9 9 磷酸氢二钠(N
14、 a,H P 0,7 H 2 0)溶解于8 0 0 m L水中。临用前加人约5 g 抗坏血酸，并调节p H至6.83.8-2.5 鸡胰酶:称取1 0 0 m g 干燥的鸡胰酶，加人2 0 m l 磷酸缓冲液制成匀浆，3 0 0 0 r/m i n 离心1 0 m i n，取上清液备用，临用前配制I8-2 6 蛋白酶一 淀粉酶 分别称取蛋白酶和淀粉酶各 2 0 0 m g，加人 2 0 m 工，磷酸缓冲液制成匀浆，3 0 0 0 r/m i n 离心1 0 m i n,，取上清液备用。临用前配制。3.8-2,7 氢氧化钠溶液(。.0 1 m o l/L):用 2 0%乙醇配制。18.2.8 氢氧
15、化钠溶液(1 0 m o l/L)o3.8-2.9 叶酸标准储备液(2 0 0 l c g/m L):准确称取 2 0 0 m g 叶酸标准品 用。.0 1 m o l/L氢氧化钠溶液溶解并定容至1 1。储存于棕色瓶中。G s/T 1 4 9 2 4 1 1 一2 0 0 118.2.1 0 叶酸标准中间液(2 0 0 n g/m L):吸取l.0 mL叶酸标准储备液，用。.0 1 m o l/I氢氧化钠溶液溶解井定容至 1 1。储存于棕色瓶中。3-8.2-1 1 叶酸标准应用液(0.2 n g/m L):吸取 1.0 m1叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定容至11。18.2.1 2 酶解酪蛋
16、白:将8 g 碳酸氢钠溶解于1 L水中，加人6 0 g 去维生素酪蛋白，用1 0 m o l l 氢氧化钠溶液调节p H至8.。加人3 0 0 m g 胰酶，搅拌2 0 m i n，使胰酶充分混匀。再加人 2.5 m l甲苯，置3 7 C 恒温箱酶解4 8-7 2 h。将酪蛋白从恒温箱中取出，经1 2 1 C 高压3 0 m i n以终止反应，去除甲苯 冷却，加l o g 硅藻土(技术级)搅拌，用布氏漏斗过滤。滤液中加人约6 0 m L冰乙酸调节p H至3.7。称取活性炭1 2 g，加至滤液中搅拌1 0 m i n，用布氏漏斗过滤，重复三次 每次过滤时，布氏漏斗内加l o g 硅藻土助滤。最后滤液用水稀释至1 2 0 0 m L,冰箱保存。取一小份酶解酪蛋白液进行干燥处理，如固体含量小于4 0 m g/m 工，则需重新制备。18.2.1 3 黄嗓吟溶液:取。.4 g 黄嚷吟，加人l o m 工、氨水，加热溶解.用水稀释至1 0 0 m 工。冰箱保存18.2.1 4 腺嚓吟 鸟嗓吟一 尿11 1 PT 溶液:分别称取硫酸腺嗓吟 盐酸鸟嗦吟和尿rf92各。.2 g，加人(1+4)盐酸溶液，
