1、G B/T 1 6 3 4 4 一 1 9 9 6前里 岁 咖啡因（c a f f e i n e）又名咖啡碱，属 甲基黄嗓吟化合物，化学名称为 1,3,7 一 三甲基黄嘿吟，具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。为此，各国制定了咖啡因在饮料中的食品卫生标准。美国、加拿大、阿根廷、日 本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过2 0 0 m g/L，南斯拉夫规定不得超过1 2 0 m g/L,到目前为止我国仅允许咖啡因加入到可乐型饮料中，其含量不得超过 1 5 0 m g/k g，为了加强食品卫生监督管理，建立咖啡因的标准测定方法十分必要。紫外分光光度法和高效液相色谱法（H P L C）是可
2、乐型饮料、咖啡和茶叶以及制成品中咖啡因含量的测定方法。其方法简单、快速、准确。最低检出浓度：紫外法对可乐型饮料为3 m g/L；对咖啡、茶叶及其固体制品为5 m g/1 0 0 g；对咖啡和茶叶的液体制品为5 m g/L o H P L C法对可乐型饮料为0.7 2 m g/1.;对茶叶、咖啡及其制品为1.8 m g/1 0 0 g o 本标准的附录 A为提示的附录。本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准起草单位：上海市食品卫生监督检验所、上海卫生检疫局。本标准主要起草人：第一篇为何倩琼、郑理、方有宗、李绍良；第二篇为李绍良、庄慎谦、毛显林、何情琼。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监
3、督检验所负责解释。中华 人 民 共 和 国 国 家标 准c B/T 1 6 3 4 4 一 1 9 9 6饮料中咖啡 因的测定方法Me t h o d f o r d e t e r mi n a t i o n o f c a f f e i n e i n b e v e r a g e s范围 本标准规定了可乐型饮料、咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含量的测定方法紫外分光光谱法和高 效液相色谱法（H P L C),本标准适用于可乐型饮料、咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因的测定。第一篇紫外分光光谱法2 原理 咖啡因的三氯甲烷溶液在2 7 6.5 n m波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成
4、正比，从而可进行定量。3 试剂 本标准所用试剂均为分析纯试剂，实验用水为蒸馏水。3.1 无水硫酸钠。3.2 三氯甲烷：使用前重新蒸馏。3.3 1.5%(m/V)高锰酸钾溶液：称取1.5 g 高锰酸钾，用水溶解并稀释至1 0 0 mL o3.4 亚硫酸钠和硫氰酸钾混合溶液：称取l o g 无水亚硫酸钠（N a 2 S 0 3)，用水溶解并稀释至1 0 0 m L。另取1 0 g 硫氰酸钾，用水溶解并稀释至1 0 0 mL，然后二者均匀混合。3.5 1 5/(V/V)磷酸溶液：吸取1 5 m l,磷酸置于1 0 0 m l,容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。3.6 2 0 o o(m/V)氢氧化钠溶
5、液：称取2 0 g 氢氧化钠，用水溶解，冷却后稀释至1 0 0 mL o3.7 2 0 o o(m/V）乙酸锌溶液：称取2 0 g乙酸锌 Z n(C H,C O O)2 2 H 2 0 ，加入3 m l,冰乙酸，用水溶解并稀释至1 0 0 m L 43.8 1 0%(m/V）亚铁氰化钾溶液；称取 1 0g亚铁氰化钾 K,F e(C N)s 3 H 2 0 用水溶解并稀释至1 0 0 mL,3.9 咖啡因标准品：含量9 8.0 以上。3.1 0 咖啡因 标准储备液：根据咖啡因 标准品的含量用重蒸三氯甲 烷配制成每毫升相当于。.5 m g 咖啡因的溶液，置于冰箱中保存。4 仪器紫外分光光度计。中华
6、人民共和国卫生部 1 9 9 6 一 0 6 一 1 9 批准1 9 9 6 一 0 9 一 0 1 实施GB/T 1 6 3 4 4 一 1 9 9 65 分析步骤5.1 样品的处理5.1.1 可乐型饮料：在 2 5 0 m L的分液漏斗中，准确移入 1 0.0 -2 0.0 m L经超声脱气后的均匀可乐型饮料试样，加入 1.5 高锰酸钾溶液 5 mL，摇匀，静置 5 m i n，加入混合溶液 1 0 m L，摇匀，加入 1 5 磷酸溶液 1 m L，摇匀，加入 2 0 氢氧化钠溶液 1 m L，摇匀，加入 5 0 m L重蒸三氯 甲 烷，振摇 1 0 0 次，静止分层，收集三氯甲烷。水层再
7、加入 4 0 mL重蒸三氯甲烷，振摇 1 0 0 次，静置分层。合并二次三氯甲烷萃取液，并用重蒸三氯甲烷定容至 1 0 0.m l.，摇匀，备用。5.1.2 咖啡、茶叶及其固体制成品：在 1 0 0 m l.烧杯中称取经粉碎成低于 3 0目的均 匀样品。.5-2.0 g，加入8 0 m L沸水，加盖，摇匀，浸泡2 h，然后将浸出液全部移入1 0 0 mL容量瓶中，加入2 0 乙酸锌溶液 2 m L，加入 1 0 亚铁氰化钾溶液 2 m L，摇匀，用水定容至 1 0 0 m L，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液5.0-2 0.0 m L按5.1.1 操作进行，制备成1 0 0 m L三氯甲烷溶液，备
8、用。5.1.3 咖啡或茶叶的液体制成品：在1 0 0 m L容量瓶中准确移入1 0.0 2 0.0 mL均匀样品，加入2 0乙酸锌溶液 2 r n l.，摇匀，加入 1 0 亚铁氰化钾溶液 2 m l-，摇匀，用水定容至 1 0 0 m L，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液 5.0 -2 0.0 m l,按 5.1.1 操作进行，制备成 1 0 0 m l.三氯甲烷溶液，备用。5.2 标准曲线的绘制 从。.5 m g/m l“的咖啡因 标准储备液中，用重蒸三氯甲 烷配制成浓度分别为0,5,1 0,1 5,2 0 ji g/m L的标准系列，以。t g/m L作参比管，调节零点，用1 c m比色杯于
9、2 7 6.5 n m下测量吸光度，作吸光度一 咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。5.3 样品的测定 在2 5 m L具塞试管中，加入5 g 无水硫酸钠，倒入2 0 m L样品的三氯甲烷制备液，摇匀，静置。将澄清的三氯甲烷用1 c m比色杯于2 7 6.5 n m测出其吸光度，根据标准曲线（或直线回归方程）求出样品的吸光度相当于咖啡因的浓度。(p g/m L)，同时用重蒸三氯甲 烷作试剂空白。6 结果6.1式 中计算：可乐型饮料中咖啡因含量(m g/L）一(c 一c,)又1 0 0 V、1 0 0 0 x 二 一 气 或二二 1 UVU （1）咖啡、茶叶及其固体制成品中咖啡因含量(m g
10、/1 0 0 g)=(c 一c)X1 0 0 X1 0 0 X1 0 0V,XMX10 0 0咖啡或茶叶的液体制成品中咖啡因含量(m g/1,)=(c 一c o)X 1 0 0 X 1 0 0 X l 0 0 0（2）V,XVX10 0 0（3）6.2：。样品吸光度相当于咖啡因浓度，pk g/mL;。试剂空白吸光度相当于咖啡因浓度，tt g/m L;m 称取样品的质量，g;V 移取样品的体积，m L;V,移取样品处理后水溶液的体积,m L.在本实验条件下：本法仪器检出限为0.2 u g/m L，方法检出限可乐型饮料为3 m g/L，咖啡、茶叶及其固体制成品为5 m g/1 0 0 g，咖啡或茶
11、叶的液体制品为5 m g/L a 标准曲 线线性范围：0.0 -3 0.0 t g/m L.相关系数：0.9 9 9 0G B/T 1 6 3 4 4 一 1 9 9 6 方法回归率；9 0.1 0 o-1 0 1.8 0 0 0 相对标准偏差：小于4.O Y o a6 3 允许差；同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值可乐型饮料为1 0%，咖啡、茶叶及其制品为 1 5。第二篇高效液相色谱法（H P L C)7 原理 咖啡因的甲醇液在2 8 6 n m波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。8 试剂8.8.甲醇;HP L C试剂。乙睛：H P I,C试剂。
12、三氯甲烷；分析纯（必要时须重蒸）。超纯水（1 8.2 MS 2)a无水硫酸钠：分析纯。氯化钠：分析纯。咖啡因标准品：纯度 9 8 以上。闷八乙口口月马叹U了188，8 88.9 仪器和设备液相色谱。色谱柱B o n d a p a k T C l 8(3 0 c m X3.9 m m i d)a预柱R E S A V E T M C 1 8,超声清洗器（C Q 2 5 0)a混纤微孔滤膜。咋八艺勺口八匕n匕月尸曰八切nJ分析步骤月月月1 0.1 1 0.1 1 0-1.2样品的处理 可乐型饮料.1 脱气：样品用超声清洗器在4 0 下超声5 m i n e.2 过滤：取脱气试样1 0.0 m L
13、通过混纤微孔滤膜过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 m L备用。咖啡、茶叶及其制成品 六曰U八U点IIU！门月 称取2 g已经粉碎且小于3 0目的均匀样品或液体样品放入1 5 0 m L烧杯中，先加2-3 m L超纯水，再加 5 0 m L三氯 甲 烷，摇匀，在超声处理机上萃取 1 m i n(3 0 s 二次），静置 3 0 m i n，分层。将萃取液倾入另一1 5 0 m I，烧杯。在样品中再加5 0 m L三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤，弃去样品，合并二次萃取液，加入少许无水硫酸钠和 5 mL饱和氯化钠，过滤，滤入 1 0 0 m L容量瓶中，用三氯甲烷定容至1 0 0 m L。最后取1
14、 0 m L滤液按 1 0.1.1.2 操作进行。1 0.2 色谱条件1 0.2.1 流动相：甲醇：乙睛：水5 7：2 9：1 4（每升流动相中加入 0.8 mo l/L乙酸液 5 0 m L)o1 0-2.2 流动相的流速：1.5 m L/m in a1 0-2.3 进样：可乐型饮料 1 0 I L，茶叶、咖啡及其制成品 5 2 0 I.L oG B/T 1 6 3 4 4 一 1 9 9 61 0.3 标准曲线的绘制 用甲醇配制成咖啡因浓度分别为。,2 0,5 0,1 0 0,1 5 0 t g/m L的标准系列，然后分别进样1 0 f tL于波长为 2 8 6 n m处测量峰面积，作峰面
15、积一 咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。1 0.4 样品测定 从试样中吸取可乐饮料 1 0 p.L或咖啡、茶叶及其制品 5 m L进样，于 2 8 6 n m处测其峰面积，然后根据标准曲线（或直线回归方程）得出样品的峰面积相当于咖啡因的浓度 (ti g/mL)。同时作试剂空白。1 1 结果1 1.1 计算：可乐型饮料中咖啡因含量（m g/L)=c 咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含量（m g/1 0 0 g)=式中：F 进样量是 5 Ii L的倍数。1 1.2 在本实验条件下：l o cF （4）（5）本法仪器检出限为。.7 2 t L g/m L，方法检出限：可乐型饮料为0.7 2 m g
16、/L，咖啡、茶叶及其制品为1.8 m g/1 0 0 g o 标准曲线线性范围：0.0 -1 5 0.0 ji g/m L.相关系数：0.9 9 9 0 方法回收率：9 1.9 0 0 1 0 5.8 0 0 0 相对标准偏差：小于 2 0 o 01 1.3 允许差：同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值可乐型饮料为5%，咖啡、茶叶及其制品为1 0。cB/T 1 6 3 4 4 一 1 9 9 6 附录A （提示的附录）饮料中咖啡因的测定方法A 1 方法研制及验证结果 方法研制及验证结果见表A 1 及表A g o 表A 1 紫外分光光谱法研制及验证结果表 A 2 高效液相色谱法研制及验证结果G s/r 1 6 3 4 4 一 1 9 9 6表 A 2（完）单位研制单位验证单位上海卫生检疫局上海市食品卫生监督检验所上海长宁区卫生防疫站样品名称可乐型饮料咖啡新茶可 乐型饮料夭然咖啡茶叶可乐饮料即溶咖啡标准差 S0.3 31 71.3 3 2 32 8.302 2.341 1 9.1 146.601.337 0.1 4相对标准差C V 0.4 91.3 60.7 30.8 53.1
