1、I C S 6 7.1 8 0.1 0X 3 1中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T 1 8 9 3 2.2 5-2 0 0 5 蜂蜜中青霉素G、青霉素 V、乙氧蔡青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素残留量的测定方法 液相色谱一 串联质谱法Me t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f p e n i c i l l i n G,p e n i c i l l i n V,n a f c i l l i n,o x a c i l l i n,c l o x a c i l l i n,d i c l o x a c
2、i l l i n r e s i d u e s i n h o n e y-LC-M S-MS me t h o d2 0 0 5-0 2-0 4发布2 0 0 5-0 8-0 1 实施中 华人民 共 和国国 家质 量监督 检 验检疫 总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布GB/T 1 8 9 3 2.2 5-2 0 0 5前言GB/T 1 8 9 3 2本部分的附录 A、附录 B为资料性附录。本部分由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。本部分由中华全国供销合作总社归口本部分起草单位:中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。本部分主要起草人:庞国芳、李学民、张进杰、曹
3、彦忠、范春林、刘永明、赵为、郭彤彤、石玉秋。本部分系首次发布的国家标准。GB/T 1 8 9 3 2.2 5-2 0 0 5 蜂蜜中青霉素 G、青霉素 V、乙氧蔡青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素残留量的测定方法 液相色谱一 串联质谱法范围 G B/T 1 8 9 3 2的 本部分规定了蜂蜜中青霉素G、青霉素V、乙氧蔡青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素残留量的液相色谱一 串联质谱测定方法。本部分适用于蜂蜜中青霉素 G、青霉素V、乙氧蔡青霉素、苯哩青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素残留量的测定。本部分的方法检出限:青霉素G、青霉素V、苯噢青霉素为1.0 p g/k g;邻氯青霉素、双
4、抓青霉素为2.0 p g/k g;乙氧禁青霉素为0.5 p g/k g,2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 G B/T 1 8 9 3 2的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6 3 7 9 测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性(G B/T6 3 7 9-1 9 8 6,n e q I S O 5 7 2 5:1 9 8 1)GB/T 6 6 8 2分析实
5、验 室用水规格 和试 验方法(GB/T 6 6 8 2-1 9 9 2,n e q I S O 3 6 9 6:1 9 8 7)3原理 试样中青霉素残留，用去离子水溶解后，溶液用 O a s i s HL B或相当的固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。4 试荆和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为 G B/T 6 6 8 2 规定的一级水。4.1 甲醇:色谱纯。4.2 乙睛:色谱纯。4.3 乙酸:优级纯。4.4 乙睛+水(1+3):量取 2 5 mL乙腊(4.2)与7 5 mL水混合。4.5 O a s i s HL B固相萃取柱或相当者:5 0 0 mg,6 ml,
6、。使用前分别用 5 mL甲醇(4.1)和 1 0 mL水预处理，保持柱体湿润。4.6 青霉素 G、青霉素 V、乙氧禁青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素标准物质:纯度)9 9%.4.7 青霉素 G、青霉素 V、乙氧蔡青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素标准储备溶液:准确称取适量的每种标准物质(4.6)，分别用乙睛(4.4)配制成浓度为1.0 m g/mL的标准储备溶液。储备液贮存在一1 8 冰柜中。4.8 青霉素 G.青霉素V、乙氧蔡青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素标准工作溶液:根据需GB/T 1 8 9 3 2.2 5-2 0 0 5要吸取适量青霉素 G、青霉素 V、乙
7、氧蔡青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素标准储备溶液(4.7)，用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液。5仪器5.1 液相色谱一 串联四极杆质谱仪:配有电喷雾离子源(E S I).5.2 分析天平:感量0.1 m g 和。.0 1 g 各一台。5.3 液体混匀器。5.4 固相萃取真空装置。5.5 贮液器:5 0 mL.5.6 微量注射器,2 5 p L,1 0 0 p L.5.7 刻度样品管:5 mL，精度为 0.1 mL,5.8 真空泵:真空度应达到8 0 k P a,5.9 p H计:测量精度士。.0 2.5.1 0 氮气吹干仪。试样 的制备与保存6.1 试样的制备 对
8、无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过 6 0 的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。分出。.5k g 作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。5.2 试样保存 将试样于常温下保存。测定步骤7.1 试样溶液的制备 称取 5g 试样(精确到。0 1 g)置于1 5 0 mL三角瓶中，加人 2 5 mI去离子水，于液体混匀器上快速混合1 m i n，使试样完全溶解。样液移至下接O a s i s H L B柱(4.5)的 贮液器中，以 小于或等于3 m L/m i n的流速通过 O a s i。固相萃取柱后，用 5 m1水洗柱，
9、弃去全部流出液。在“k P a的负压下，减压抽干2 0 min，最后用 3 m 1 _ 甲醇(4.1)洗脱，收集洗脱液于刻度样品管(5.7)中，于 4 0 水浴中用氮气吹干仪吹干，用乙睛(4.4)定容至 1 mL，摇匀后，供液相色谱一 串联质谱仪测定。7.2测定7.2.1 液相色谱条件 a)色 谱柱:S u n F i r e Q s 3.5 p m,1 5 0 m m X 2.1 m m(内径)或相当者;b 流动相及流速见表 1;c)柱温:3 0 0 C;d)进样量,2 0 K I。表 1 液相色谱梯度洗脱条件时 间/min流速/(p L/min)水(含。.4%乙酸)/(%)乙睛八%)0.0
10、 02 0 06 0.040.01 5.0 02 0 03 5.06 5.01 5.012 0 06 0.04 0.02 5.0 12 0 06 0.04 0.0GB/T 1 8 9 3 2.2 5-2 0 0 57.2.2质谱条件离子源:电喷雾离子源(E S I);扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测;电喷雾电压:5 5 0 0 V;雾化气压力:0.0 5 5 M P a;气帘 气压力:0.0 7 9 MP a;辅助气流速:6 L/mi n;离子源温度:4 0 0 0 C;定性离子对、定量离子对和去簇电压(D P),聚焦电压(F P)、碰撞能量(C E)及碰撞室出口电压(C X P)，
11、见表2.六种青公素的定性离子对、定f离子对、去簇电压、聚焦电压、碰撞能f和碰撞室出口电压a)b)c)d)e)幻目h)i)表 2名 称 定 性离 子 对/(m/a)定 量离 子 对/(m/-)碰 撞能 量/v去 簇电压/v聚 焦电 压/v 碰 撞 室出 口电 压/v青霉素G3 3 5/1 6 03 3 5/1 7 63 3 5/1 6 0:4 52 0 01 1青霉素v3 5 1/1 6 03 5 1/1 9 23 5 1/1 6 0:4 02 0 01 1苯 哇 青 霉 素4 0 2/1 6 04 0 2/2 4 34 0 2 门 6 0:4 52 0 01 1邻氯青霉素4 3 6/1 6 0
12、4 3 6/2 7 74 3 6/1 6 0:5 02 0 01 1乙氧蔡青霉素4 1 5/1 9 94 1 5/2 5 64 1 5/1 9 9:;4 52 0 01 1双氯青霉素4 7 0/1 6 04 7 0/3 1 14 7 0/1 6 0:s o2 0 01 17.2.3 液相色谱一 串联质谙测定7.2.3.1 定性测定 在相同试验条件下，样品中待测物质与同时检测的标准品具有相同的保留时间，并且所选择的两对离子丰度比相一致，则可判定为样品中存在该残留。7.2.3.2定f测定 在仪器最佳工作条件下，用青霉素G、青霉素 V、乙氧禁青霉素、苯哩青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素标准储备溶液配成
13、的基质混合标准溶液(4.8)分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中青霉素 G、青霉素V、乙氧蔡青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，青霉素G、青霉素 V、乙氧禁青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素的总离子流图参见图A.1。青霉素 G、青霉素V、乙氧蔡青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素的保留时间和离子丰度比见表 3 3GB/T 1 8 9 3 2.2 5-2 0 0 5表 3六种青忍素的参考保 留时 间和 离子丰度 比青霉素名称定性离子对/(m/z)
14、离子对丰度比/(%)保留时间/min青 霉 素 G3 3 5/1 6 03 3 5/1 7 610 08 77.4 4青 霉 素V3 5 1/1 6 03 5 1 八 9 2:。:9.2 1苯哩青霉素4 0 2/1 6 04 0 2/2 4 310 07 61 0.5 6邻抓青霉素4 3 6/1 6 04 3 6/2 7 710 08 31 2.4 9乙氧禁青裤素4 1 5/1 9 94 1 5/2 5 610 01 31 3.0 5双抓青霉素4 7 0/1 6 04 7 0/3 1 110 04 21 5.6 0本方法的添加回收率数据参见表 B.1,平行试验按上述步骤，对同一试样进行平行试验
15、测定。空白试验除不称取试样 外 均按 上述分 析步骤进行。结果计 算蜂蜜中青霉素残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算:1 0 0 01 0 0 0(1)XV-爪 X f式 中:X 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(K g/k g);c 从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(n g/m L);V 试样溶液定容体积，单位为毫升(mL);m 最终试样溶液所代表的 试样 质量，单位为克(9)。注:计 算 结 果 需 将 空 白 值 扣 除。精密度 本部分的精密度数据是按照G B/T 6 3 7 9 的规定确定的，其重复性和再现性的值以9 5%的可信度来计算。9.1
16、 重复性 在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，蜂蜜中青霉素 G、青霉素 V、乙氧蔡青霉素、苯哇青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素含量范围及重复性方程见表 4 0 如果两次测定值的差值超过重复性限(r)，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2再现性 在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，蜂蜜中青霉素 G、青霉素 V、乙氧蔡青霉素、苯噢青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素含量范围及再现性方程见表4GB/T 1 8 9 3 2.2 5-2 0 0 5表 4 六种青扭素含f范围及重复性和再现性方程青霉素名称含量范围/(g/k g)重 复 性 限 r再 现 性 限 R青 霉 素 G1-4 0I g r=1.0 0 2 7 lg m-1.0 9 4 6l g R=0.8 8 6 0 I g m-0.6 2 7 7青 霉 素 V1-4 0Ig r=0.9 8 0 9 l g m-1.1 4 8 0I g R=0.9 5 7 2 I g m-0.6 4 5 1苯噢青霉素1-4 0Ig r=0.7 5 7 9 Ig m-0.9 1 6
