1、I C S 6 7.1 8 0.1 0X 3 1中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 8 9 3 2.2 8-2 0 0 5蜂蜜中四环素族抗生素残留量测定方法 酶 联 免 疫 法Me t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f t e t r a c y c l i n s a n t i b i o t i c s r e s i d u e s i n h o n e y-E n z y me-l i n k e d i m mu n o s o r b e n t a s s a y me t h o d2 0 0
2、 5-0 2-0 4发布2 0 0 5-0 8-0 1 实施中 华 人民 共 和国国 家 质量监 督检 验检 疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布GB/T 1 8 9 3 2.2 8-2 0 0 5前言G B/T 1 8 9 3 2的本部分的附录A为资料性附录。本部分由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。本部分由中华全国供销合作总社归口。本部分起草单位:中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。本部分主要起草人:庞国芳、付宝莲、张进杰、肖艳霞。本部分系首次发布的国家标准。GB/T 1 8 9 3 2.2 8-2 0 0 5蜂蜜中四环素族抗生素残留量测定方法 酶 联 免
3、疫 法范围GB/T 1 8 9 3 2的本部分规定了蜂蜜中四环素族抗生素残留量酶联免疫测定方法本部分适用于蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定。本部 分的方法检出限:四 环素族抗生素为1 5.0 0 p g/k g,2规范性 引用文件 下列文件中的条款通过 G B/T 1 8 9 3 2 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。G B/T 6 3 7 9 测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法
4、的重现性和再现性(GB/T 6 3 7 9-1 9 8 6,n e q I S O 5 7 2 5:1 9 8 1)G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法(G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2,n e q I S O 3 6 9 6:1 9 8 7)G B/T 1 8 9 3 2.2 3 蜂蜜中 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留 量的测定方法液相色谱一 串联质谱法原理 试样中残留的四环素族抗生素与微孔板中结合的四环素族抗生素共同竞争四环素族抗生素抗体，在酶标记物的作用下，形成的酶标记抗原抗体复合物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中四环素族抗
5、生素的含量。4试荆和材料4.1 四环素族抗生素试剂盒:4.1.1 9 6 孔板:1 2 条X8 孔。4.1.2 四环素族抗生素标准溶液。4.1.3 四环素族抗生素抗体溶液。4.1.4 四环素族抗生素酶标记物溶液4.1.5基质。4.1.6 显色剂。4.1.7 反应停止液4.2 磷酸二氢钠(N a H,P O,2 H2 0):优级纯。4.3 磷酸氢二钠(N a,H P 0 4 1 2 H,0):优级纯。4.4 氯化钠:优级纯。4.5吐温 2 0:分析纯。4.6 磷酸盐缓冲溶液:p H一7.4。分别称取。.6 2 g磷酸二氢钠(4.2),5.7 3 g磷酸氢二钠(4.3)和 9g氯化钠(4.4)于
6、1 0 0 0 mL中，在p H计上调节溶液 p H=7.4.IGB/T 1 8 9 3 2.2 8-2 0 0 54.7 洗板溶液:p H=7.2-7.4。分别称取。.6 2 g 磷酸二氢钠(4.2),5.7 3 g 磷酸氢二钠(4.3)和9 g 氯化钠(4.4)于1 0 0 0 mL中，再加 1 mL吐温(4.5)，在 p H计上调节溶液 p H=7.2 -7.4,4.8 四环素族抗生素基质标准工作溶液:根据四环素族抗生素试剂盒(4.”的线性范围，用空白蜂蜜样品提取液将四 环素族抗生素标准溶液(4.1.2)按1，9 进行稀释成不同 浓度印g/k g)的标准工作溶液。每次测定用的标准工作溶液
7、均应现配现用。4.9 水:GB/T 6 6 8 2 规定的一级水。5仪器5.1 酶标仪。5.2 8道移液器:5 0 p L-3 0 0 p l。5.3 单道移液器:5 p L-5 0 p L,1 0 0 p L-1 0 0 0 p I和2 ml 一1 0 mL,5.4 液体混匀器。5.5 超声波水浴5.6 注射过滤器:2 mL-5 mL，并带有孔径为。.4 5 p m的水相针头式过滤膜。5.7 具塞试管;1 0 m L,5 0 m L,5.8 p H计:测量精度士。.o 26 试样的制备与保存6.1 试样的制备 对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的实验室样品，在密闭的情况下，置于不超
8、过6 0 的水浴中温热、振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温，分出0.5 k g作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识。6.2 试样的保存 将样品于室温下保存7分析步骤7.1 提取 称取 1 g 试样，精确到。.0 1 g，置于 5 0 ml具塞试管中，加人 1 0 MI磷酸盐缓冲溶液(4.6)于液体混匀器上快速混匀 1 mi n，使试样完全溶解。再加人 3 9 mL磷酸盐缓冲溶液后，将试管置于超声波水浴中超声5 mi n，取出摇匀，用注射过滤器将适量的样品溶液过滤至 1 0 MI具塞试管中，供酶标仪测定。此溶液稀释系数为5 0,7.2 测定条件 以下所有操作应在 2 0 0C
9、-2 4 室温下进行。7.2.1 酶标仪测定条件:酶标仪测定波长为4 5 0 n m,7.2.2 人工洗板条件:洗涤次数五次以上，每次注水量为2 5 0川。7.2.3 四环素族试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(2 0-C-2 4-C)后方可使用。7.2.4 将测定需用的微孔板(4.1.1)备齐并插人微孔架上，记录标准及样品等在微孔架上的位置(模板图)。7.3测定 测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。7.3.1 分别吸取 5 0可，四环素族标准工作溶液(4.8)和样品溶液等，按模板图位置依次加人各自的微孔底 部。7.3.2 吸取 5 0越 四环素族抗体溶液(4.1.3)于每一个微孔底
10、部，然后，用封口膜密封孔口以防溶液挥GB/T 1 8 9 3 2.2 8-2 0 0 5发。持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于2 0 0C-2 4 0C避光孵育 6 0 min.7.3.3 倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液(但不能使微孔干燥)，然后，立即用洗板溶液(4.7)按 7.2.2 要求进行洗板。每次弃去洗板溶液后，均应将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干燥。7.3.4 迅速加人 1 0 0 f L四环素族酶标记物溶液(4.1.4)于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于2 0 0 C-2
11、4 0 C 避光孵育1 5 m i n,7.3.5 按 7.3.3 步骤重复操作。7.3.6 迅速加人5 0 t L 基质(4.1.5)和5 0 p L 显色剂(4.1.6)于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于2 0 0C -2 4 0C避光孵育 1 5 m i n.7.3.7 迅速加人 1 0 0 V L反应停止液(4.1.7)于每一个微孔底部。然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在 4 5 0 n m处测量吸光度(加人反应停止液后应在 6 0 m i n内读取吸光度)。7.4平行试验 按以上步骤，对同一标准、同一样品溶液均应进行平行
12、试验测定。7.5 空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。7.6 监控试验 每次测定均应做一个添加四环素族抗生素标准的空白样品。8结果计算 在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标(%)，四环素 族抗生素标准工作溶液浓度(y g/k g)为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的四环素族抗生素浓度后，结果按公式(1)计算:1 0 0 01 0 0 0.(1)V-明 f -一 X式 中:X 试样中四 环素族抗生素残留量，单位为微克每千克(v g/k g);c 从标准工 作曲线上得到的试样中四 环素族抗生素 浓度，单位为微克每千克(K g/k g);V 样品溶液的体积，单位为毫升
13、(MI _);m 样品溶液所含的试样质量，单位为克(g).结果表示到小数点后两位。注:计算结果应扣除空白值。9 确证试验 如被测样品中四环素族抗生素残留量的值大于检出限时，应用 L C-MS-MS法进行确证1 0精密度 本部分的精密度数据是按照G B/T 6 3 7 9的规定确定的，其重复性和再现性的值是以9 5%的可信度来计算。1 0.1 重复性 在重复 性条件下，蜂蜜中四环素 族抗生素的含量在1 5.0 0 p g/k g-2 0 0.0 0 W g/k g 范围 时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，本部分的重复性限按方程式(2)计算:馆r 一 1.1 2 3 9 1
14、 g m一1.4 2 1 3 (2)3GB/T 1 8 9 3 2.2 8-2 0 0 5 式 中:m 两次测定值的平均值，单位为微克每千克(u g/k g),如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。1 0.2再现 性 在再现性条件下，蜂蜜中四环素族抗生素的含量在1 5.0 0 p g/k g-2 0 0.0 0 k g/k g 范围 时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性(R)，本部分的再现性限按方程式(3)计算:R=0.0 9 5 9 m+1.4 7 4 5 (3)式 中:m 两次测定值的 平均值，单位为 微克每千克(K g/k g).GB/T 1 8 9 3 2.2 8-2 0 0 5 附录A (资料性附录)回收率本方法中四环素族抗生素添加浓度及回收率的试验数据:在添加量为 1 5.0 0 p g/k g时，平均回收率为”.0 0 o e在添加量为 5 0.0 0 p g/k g时，平均回收率为 9 5.9%.在添加量为 1 0 0.0 0 p g/k g时，平均回收率为8 8.4%e在添加量为 2 0 0.0 0 p g/k g时，平均回收率为 1 0 7.0%a
