1、G B/T 1 8 9 3 2.2 3-2 0 0 3前言 G B/T 1 8 9 3 2 的本部分修改采用加拿大标准A C C-0 4 2-V l.0 1 蜂蜜中四环素残留量测定液相色谱质谱法.修改的主要内容是:淋洗液由甲醇改为乙酸乙醋;增加了筱酸型阴离子交换柱净化;单四极杆质谱检测器改为串联四极杆质谱检测器。本部分的附录A和附录 B为资料性附录。本部分由国家质量监督检验检疫总局提出。本部分由中华全国供销合作总社归口。本部分起草单位:中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。本部分主要起草人:庞国芳、张进杰、曹彦忠、贾光群、范春林、刘永明、李学民、石玉秋。本部分系首次发布的国家标准。G B/T
2、1 8 9 3 2.2 3-2 0 0 3蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定方法 液相色谱一 串联质谱法范围G B/T 1 8 9 3 2 的本部分规定了蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱一 串联质谱测定方法本部分适用于蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。本部分的方法检出限:土霉素、四环素为。.0 0 1 m g/k g;金霉素、强力霉素为。0 0 2 m g/k g,2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过G B/T 1 8 9 3 2 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不
3、适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日 期的引用文件，其最新版本适用于本部分 G B/T 6 3 7 9 测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性(G B/T6 3 7 9-1 9 8 6,n e q I S O 5 7 2 5:1 9 8 1)G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法(G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2,n e q I S O 3 6 9 6;1 9 8 7)3 原理 试样中四环素族抗生素残留，用。.1 m o l/L N a,E D T A-Mc l l v a i n e
4、(p H=4.。士。.0 5)缓冲溶液提取提取液经离心后，上清液用O a s i s H L B或相当的固相萃取柱和阴离子交换柱净化，液相色谱一 串联质谱仪测定，外标法定量。4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为G B/T 6 6 8 2 规定的一级水。4.1 甲醇:色谱纯4.2 乙睛:色谱纯。4.3 乙酸乙酷:色谱纯。4.4 磷酸氢二钠(N a z H P 0,2 H 2 0):优级纯。4.5 柠檬酸(C,H a 0,Hz 0),4.6 乙二胺四乙酸二钠(N a 2 E D T A 2 H2 0),4.7草酸。4.8磷酸氢二钠溶液:0.2 m o l/L。称取2 8.4 1
5、g 磷酸氢二钠(4.4)，用水溶解，定容至 1 0 0 0 m L4.9 柠檬酸溶液:0.1 m o l/L。称取2 1.0 1 g 柠檬酸(4.5)，用水溶解，定容至1 0 0 0 m L,4.1 0 Mc l l v a i n e 缓冲溶液:将1 0 0 0 m L 0.1 m o l/L柠檬酸溶液(4.9)与6 2 5 m L 0.1 m o l/L磷酸氢二钠溶液(4.8)混合，必要时用N a O H或H C l 调p H=4.0 士0.0 5,4.1 1 N a,E D T A-Mc l l v a i n e 缓冲溶液:0.1 m o t/L。称取 6 0,5 g乙二胺四乙酸二钠(
6、4,6)放人 1 6 2 5m L Mc l l v a i n e 缓冲溶液(4.1 0)中，使其溶解，摇匀。tG B/T 1 8 9 3 2.2 3-2 0 0 34.1 24.1 3甲醇+水(1-1 9):量取 5 mL甲醇(4.1)与 9 5 m L水混合。O a s i s H L B固 相萃取柱或相当者:5 0 0 m g,6 m L。使用前分别用5 m L甲醇和1 0 m L水预处理，保持柱体湿润。4.1 44.1 54.1 6阴离子交换柱:竣酸型,5 0 0 m g,3 m L。使用前用 5 m L乙酸乙酩预处理，保持柱体湿润土霉素土霉素四环素、金霉素、强力霉素标准物质:纯度)
7、9 5%0四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液:。.1 m g/m L。准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质(4.1 5)，分别用甲醇配成 0.1 m g/mL的标准储备液。储备液贮存在一1 8 冰柜中。4.行 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素基质混合标准工作溶液:根据需要吸取适量土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液(4.1 6)，用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液，基质混合标准工作溶液在4 保存，可使用三天。5 仪器5.1 液相色谱一 串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。5.2 分析天平:感量。.1 m g 和。O l g 各一台。5.3 液体混匀
8、器。5.4 固相萃取真空装置。5.5 贮液器:5 0 m L,5.6 微量注射器:2 5 fA L,1 0 0 p L,5.7 刻度样品管:5 m L，精度为。1 m L,5.8 真空泵:真空度应达到8 0 k P a,5.9 离心管:5 0 mL,5.1 0 平底烧瓶:1 0 0 m L,5.1 1 p H计:测量精度士。.0 2,6 试样的制备与保存6.1 试样的制备 对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过 6 0 的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。分出。.5 k g 作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。6.2
9、 试样保存 将试样于常温下保存。7 测定步骤7.1 提取 称取6 g 试样(精确到0.0 1 g)置于1 5 0 m L 三角瓶中，加人3 0 m L N a,E D T A-Mc l l v a i n e 缓冲溶液(4.1 1)于液体混匀器上快速混合 1 m i n，使试样完全溶解。样液倒人5 0 m L离心管中，以3 0 0 0 r/m i n离心 5 m i n，待净化。7.2 净化 将上清液(7.1)移至下接 O a s i s HL B柱(4.1 3)的贮液器中，以小于等于 3 m L/m i n通过 O a s i s 固相萃取柱后，用 5 mL甲醇+水(4.1 2)洗柱，弃去全
10、部流出液。在 6 5 k P a的负压下，减压抽干 2 0 mi n，最后用 1 5 m L乙酸乙醋(4.3)洗脱，收集洗脱液于1 0 0 mL圆底烧瓶中。按上述方法使洗脱液(7.2)在减压情况下以小于等于3 m L/m i n的流速通过阴离子交换柱(4.1 4),G B/T 1 8 9 3 2.2 3-2 0 0 3待洗脱液全部流出后，用 5 m L甲醉(4.1)洗柱，弃去全部流出液。在6 5 k P a 负压下，减压抽干5 m i n,再用 4 m L流动相洗脱，收集洗脱液于 5 m L样品管中，定容至4 m L，供液相色谱一 串联质谱仪测定。7.3 侧定7.3.1 液相色谙条件 a)色谱
11、柱:I n e r t s i l C B-3,5 K m,1 5 0 m mX 2.1 m m(i.d)或相当者;b)流动相:乙睛十甲醇+0.4%甲酸溶液(1 8-1-4+7 8);c)流速:0.2 mL/mi n;d)柱温,2 5;e)进样量:2 0 p L,7.3.2 质谱条件 a)离子源:电喷雾离子源，b)扫描方式:正离子扫描;c)检测方式:多反应监测;d)电喷雾电压:5 5 0 0 V;e)雾化气压力:0.0 5 5 MP a;f)气帘气压力:0.0 7 9 MP a;H)辅助气流速:6 L/m i n;h)离子源温度:4 3 0 0C;i)去簇电压:5 5 V;J)定性离子对、定量
12、离子对和碰撞气能量见表 1,表 1 四种四环素族抗生素定性离子对、定f离子对和进摘气能f抗生素名称定性离子对/(m/z)定量离子对/(m/z)碰按气能AN土称素4 6 1/4 2 64 6 1/4 4 34 6 1/3 8 14 6 1/4 2 62 92 03 5四环素4 4 5/4 1 04 4 5/1 5 44 4 5/4 2 84 4 5/4 1 02 84 02 0金霉素4 7 9/4 4 44 7 9 八5 44 7 9/4 6 24 7 9/4 4 43 24 02 7强力霉素4 4 5/4 2 84 4 5/4 1 04 4 5/1 5 44 4 5/4 2 82 72 74
13、07.3.3 液相色谱一 串联质谱测定 用土霉素、四环素、金霉素、强力霉素基质混合标准工作溶液(4.1 7)分别进样，以峰面积为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准总离子流图参见附录A中的图A.1。在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间见表 2。G B/T 1 8 9 3 2.2 3-2 0 0 3表 2 四种四环寮族抗生素参考保留时间抗生众名称保留时间/m m杭生素名称保留时间/m i n金霉素强力霉素8.0412
14、.07渊一3897.47.5 土每索 四环素 平行试验按以上步骤 空白试验，对同一试样进行平行试验测定。除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。8 结果计算结果按式(1)计算:VA二 二 二 c.力 之1_ 0 0 01-0 0-0。.(1)式中:X 试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克(m g/k g);从标准工作曲 线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(p g/m L);V 样品溶液最终定容体积，单位为毫升(m L);m 样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(9)。注:计算结果应扣除空白值。9 精密度本部分的精密度数据是按照G B/T 6 3 7 9 的规定确定的，重复性和
15、再现性的值以9 5%的可信度来计X _9.1素、9.2 ，复性在重复性条件下.获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，蜂蜜中土霉素、四环金霉素、强力霉素含量范围及重复性方程见表3.如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的含量范围及再现性方程见表3,表 3 含t范围及皿复性和再现性方程名称含量范围/(m g/k g)重复性限 r再现性 R土舞素0.0 0 2-0.1 0 0I g r=0.9 6 6 8 1g-O.8 6 8 6Ig R=1.
16、0 0 9 6 1 g.-O.6 5 9 7四环素0.0 0 2-0.1 0 0I g r=0.9 4 8 4 1 g.-O.8 3 7 0Ig R=1.1 6 1 1 1g.-0.2 3 1 7金称家0.0 0 2-0.1 0 0I g r=0.8 3 9 5 1 g.-1.0 8 7 2I g R=O.9 0 6 O l g m-0.8 1 3 6强力易家0.0 0 2 -0.1 0 0I g r=0.9 2 0 9 1 g m-0.8 4 6 2I g R=O.9 8 9 9 1 g m-0.6 5 0 4注:仇为两次测定结果的算术平均值.G B/T 1 8 9 3 2.2 3-2 0 0 3 附录A (资料性附录)标准物质总离子流圈土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质总离子流图，见图A.1,3.8 93.3 33.3 3 m l n 为土母嘴3.8 9 m i n 为四环索8.0 4-为金祥21 2.0 7 m i n为强力称I8.0 41 2.0 7洲种棚撇洲姗撇卿5001 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1/mi n圈 A
