1、书 书 书犐 犆犛 犅?犌犅犜?犇 犻 犪 犵 狀 狅 狊 狋 犻 犮狋 犲 犮 犺 狀 犻 狇 狌 犲 狊犳 狅 狉犫 狅 狏 犻 狀 犲狊 狆 狅 狀 犵 犻 犳 狅 狉犿犲 狀 犮 犲 狆 犺 犪 犾 狅 狆 犪 狋 犺 狔?书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准代替 牛海绵状脑病诊断技术。本标准与 相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：增补了组织病理染色法、免疫组织化学方法和免疫印迹方法的适用范围，删除了“也可用于其他动物的传染性海绵状脑病的诊断”（见第章）；优化了临床症状的描述（见）；优化了组织病理染色法操作步骤（见）和免疫组织化学方法操作步骤（见）；增补了免疫印迹方法（
2、见）。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（）归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：王志亮、刘雨田、孙成友、迟田英、宋芳芳、邹艳丽、于小静、吴晓东、王树双。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：。犌犅犜 引言牛海绵状脑病（，）是由朊病毒引起的牛的一种慢性致死性神经性疾病，对动物和人构成较大危害。世界动物卫生组织（）将其列为严重影响国际贸易的动物疫病之一，我国将其归为一类动物疫病。我国现行牛海绵状脑病诊断技术（）系 年月日由原国家质量监督检验检疫总局发布，年 月日起实施。该标准仅包括临床症状、组织病理学、免疫组织化学等三种诊断方
3、法，未包括 陆生动物手册指定的另一种确诊方法即免疫印迹。免疫印迹方法比免疫组织化学方法更灵敏，特异性更好。因此，免疫印迹方法是牛海绵状脑病诊断技术中一种更好的确诊方法，它能更好地服务于我国疯牛病的监测工作。分为典型和非典型。典型是由于牛采食污染牛羊朊病毒的肉骨粉或者饲料而引起，非典型为自然发生的一种散发性。自然条件下，经由消化道传播，未发现水平和垂直传播的证据。典型的潜伏期一般为年年，平均为年年，多发于岁的牛，岁以下罕见，岁以上明显减少。根据病原的分子量大小，非典型又分为型和型。非典型的平均发病年龄为 岁。病程多为数月至一年，最终死亡。大多数病牛无典型临床症状，因此的诊断应通过实验室检测来实现
4、。的病原是动物机体内朊蛋白的异构体，在病牛血清里检测不到朊病毒抗体，所以血清学检测方法对于来说是无意义的。目前，实验室诊断方法多以检测病原为目的，包括免疫组织化学方法、免疫印迹方法、方法等，其中免疫组织化学方法和免疫印迹方法是 手册规定的确诊方法。病牛的中枢神经被朊病毒侵害会出现海绵状空泡变性，在中枢神经保存良好且未发生自溶的情况下，应用组织病理染色法可以观察到这些病变情况。手册规定组织病理染色法是确诊的辅助方法，在使用免疫组织化学方法诊断时应同时使用组织病理染色法予以辅助确诊；在使用免疫印迹方法诊断时，如果样品适合进行组织病理染色，那么也应同时使用组织病理染色法予以辅助确诊。犌犅犜 牛海绵状
5、脑病诊断技术范围本标准规定了诊断的临床诊断、实验室诊断及综合判定技术要求。本标准适用于的诊断，其中临床诊断适用于的监测和流行病学调查，组织病理染色法适用于中枢神经系统的病理诊断，免疫组织化学方法和免疫印迹方法适用于的病原学诊断。缩略语下列缩略语适用于本文件。：牛海绵状脑病（）：苏木精伊红（）：辣根过氧化物酶（）：磷酸盐缓冲溶液（）酶：蛋白酶（）：聚偏氟乙烯（）：十二烷基硫酸钠（）：等渗缓冲盐溶液（）临床诊断 易感动物牛科和猫科动物，包括各种牛、各种羊和各种猫科动物。临床症状 行为异常表现为不安、恐惧、异常震惊或沉郁；不自主运动，如磨牙、震颤；不愿经过有缝隙的地面或进入畜栏等。感觉或反应过敏表现
6、为视、听、触三觉过于敏感。对光线的明暗变化、外部声响以及颈部触摸过度敏感，这是病牛的特征性临床表现。运动异常病牛步态呈“鹅步”状，共济失调，四肢伸展过度，有时倒地，难以站立。体重和体况下降病牛的体重和体况下降，表现出异常消瘦，体质虚弱。犌犅犜 病理变化剖检无明显病变。结果判定易感动物出现上述临床症状，又不能确定为其他疾病时，可判定为疑似。确诊应采集易感动物的脑组织进行实验室诊断。实验室诊断 犎犈组织病理染色法 实验室生物安全要求实验操作应在生物安全级以上的实验室进行。涉及有毒挥发性试剂的操作应在通风橱中进行，如甲醛、甲酸、二甲苯、氯仿等。仪器设备显微镜、切片机、电锯钢锯、骨钳、眼科剪、直形镊（
7、长约）、手术刀、切片刀、烘烤箱、脱水筐、染色缸、包埋模具、载玻片、盖玻片、玻璃棒、染色架、量筒（量程分别为 、）、通风橱。试剂 蒸馏水。中性福尔马林固定液（见附录中）。无水乙醇。二甲苯。氯仿。软蜡（熔点）。硬蜡（熔点）。苏木素染液（染液，见）。盐酸酒精（见）。饱和碳酸锂水溶液（见）。酒精伊红溶液（见）。中性树胶。无机试剂原料均为分析纯。采样将牛头固定，用电锯从前额两牛角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开，使脑部暴露。剪开脑膜并切断所有与脑部相连的神经和血管，取出整脑，包括大脑、小脑和完整脑干。大规模监测采样时，可用专用采样勺（国家牛海绵状脑病参考实验室提供）从枕骨大孔处取出延脑部组织即可。采样勺取样
8、时，先上下左右四个方向剪开脑硬膜，再用戴一次性乳胶手套的手指绕延脑转一转以切断脑神经和血管，然后紧贴颅腔壁插入采样勺，插入深度约。用力将采样勺的手柄往上翘，再往下切断脑组织，然后左右切断脑组织，最后将切下的脑组织往外抠出。犌犅犜 固定将所有组织直接放入 倍体积的 中性福尔马林固定液中渗透固定，换新配制的固定液再固定。组织切片制作 取材把大脑、小脑、脑干组织分离开，分别横切成厚的组织块，选取以下部位组织做进一步处理，包括大脑、小脑、脑桥、丘脑、四叠体、脑闩、延髓。适当修剪这七块用于检测的组织边角以适用脱水筐大小，剩余组织继续固定以备用。用脱水筐装好检测用的组织块，并用铅笔做好标记，盖好脱水筐盖。
9、投入新配制的 倍体积的固定液再固定。甲酸处理将装有组织块的脱水筐移入 甲酸中作用，自来水冲洗 ，然后再移入新配制固定液中处理。脱甲醛将装有组织块的脱水筐放入染色缸中，用缓慢流动的自来水漂洗。脱水将装有组织块的脱水筐放入染色缸中，依次在以下梯度酒精中分别脱水：）酒精浸泡。）酒精浸泡。）酒精浸泡。）酒精浸泡。）酒精浸泡。）酒精浸泡。透明 氯仿浸泡 或者二甲苯浸泡 。氯仿浸泡或者二甲苯浸泡 。浸蜡依次在以下石蜡中浸蜡，温度为：）软蜡浸泡 。）软蜡浸泡。）硬蜡浸泡。包埋 若包埋模具为金属条结构的，则先组装好包埋模具，放置在光滑平整的金属台面上，再将熔化的新硬蜡倒入包埋模具里，直至倒满，然后将浸好蜡的组
10、织块放入其中（待切片的一面朝下，并放平整）。如果一个模具里可以放置多个组织，则两个组织之间距离应大于。冷却过夜，用切片刀修犌犅犜 切成形，获得平整的石蜡组织块，然后给每个组织块贴上标签。如果包埋模具为凹型的用于单个组织包埋的模具（常见包埋机所用模具），则先将模具加热至，放置在同样温度的金属台面上，然后滴满熔化的新硬蜡，再将浸好蜡的组织块放入其中（待切片的一面朝下，并放平整），用去除盖子的脱水筐（尺寸与包埋模具匹配）放于其上，最后将整个包埋模具（包括组织等）平移至冷台上。待冷却好后，将脱水筐从包埋模具中取出，获得平整的石蜡组织块，然后给每个组织块贴上标签。切片将石蜡组织块切成厚的组织薄片。每块组
11、织连续切片片 片，切片刀、碎屑和废弃组织应焚烧处理。组织薄片用干净的粘附剂预处理过的载玻片贴片（组织应贴在磨砂面标记面的同侧，以便给玻片做标记），然后用铅笔在载玻片上做好标记。烤片贴好组织薄片的载玻片先在自然条件下晾干，然后放入烘烤箱中 烘烤以上。组织染色 脱蜡和脱二甲苯取烘烤好的玻片整齐放入染色架上，依次在以下试剂中脱蜡和脱二甲苯：）二甲苯 。）二甲苯 。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。）自来水洗。犎犈染色 苏木素染液 。自来水漂洗。盐酸酒精。自来水漂洗。饱和碳酸锂水溶液。自来水漂洗 。酒精。酒精。酒精伊红液。脱水和透明 酒精。酒精。犌犅犜 酒精。二甲苯。二甲苯。封片用干净玻
12、璃棒取一滴中性树胶，滴加在玻片的组织上，再用干净的盖玻片进行封片，放置在平整的台面上使其自然干燥。镜检及判定 分别在倍数为 、和 的光学显微镜下观察切片。阳性结果。灰质区出现空泡变性，特别是神经纤维网浆和神经细胞内有规则的圆形或卵圆形空泡，空泡内不着色或被伊红淡染，界限明显，胞核被挤压于一侧，甚至消失；有的神经细胞被单个或多个特异性空泡胀大，成为“气球样”空泡性神经细胞。容易出现空泡病变的部位是中脑和延髓的核群，且呈双侧对称性分布。阴性结果。灰质区无特征性空泡变性。在正常情况下，动眼神经核和红核处的核周质也可能有少量空泡出现，但不呈双侧对称，应注意区别。若在脑干灰质区未发现双侧对称性海绵状空泡
13、病变，则用免疫组织化学方法做进一步诊断。组织病理学诊断只是疯牛病确诊的辅助方法，确诊时应结合免疫组织化学或免疫印迹诊断方法。免疫组织化学方法 实验室生物安全要求见 。仪器设备见 。另外，还需要高压锅（温度能达到 ）、水浴锅、恒温箱、冰箱（含冷冻和冷藏）、电磁炉、金属锅（烧水用）、陶瓷锅（直径不少于）、湿盒（在玻片盒的底部铺上湿的吸水纸便成了湿盒）、微量移液器（量程分别为 、）。试剂 蒸馏水。中性福尔马林固定液（见）。无水乙醇。二甲苯。氯仿。软蜡（熔点）。硬蜡（熔点）。蛋白酶缓冲液（见附录中）。蛋白酶工作液（见）。高压缓冲液（见）。双氧水甲醇（见，如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂，则使
14、用试剂盒中的试剂）。（见）。犌犅犜 正常猪血清（见，如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂，则使用试剂盒中的试剂，但不得使用反刍动物源性血清）。氏苏木素液（商品化产品）。水溶性封片剂（商品化产品）。二步法免疫组织化学显色试剂盒（商品化产品，其中二抗应为抗鼠二抗）。一抗（商品化产品）工作液（见）。无机试剂原料均为分析纯。采样见 。固定见 。组织切片制作见 。免疫组织化学操作步骤 设置对照。免疫组织化学诊断应设置疯牛病阳性和阴性对照组织切片。脱蜡和脱二甲苯。取烘烤好的玻片和对照切片整齐放入染色架上，依次在以下试剂中脱蜡和脱二甲苯：）二甲苯 。）二甲苯 。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。
15、）酒精。）自来水洗。从自来水中取出装有玻片的染色架，在中洗 次。在洗第一次的同时，配制适量的蛋白酶缓冲液，并放入水浴锅中预热。另外，取出冷冻的蛋白酶母液使其化冻，以待用。在最后一次漂洗时，配制好蛋白酶工作液。洗完后，立即将玻片放入装有蛋白酶工作液的染色缸中，并确保玻片全部浸入液体，在 水浴中消化处理 。与此同时，准备好煮沸的蒸馏水，并配制好高压缓冲液。将高压缓冲液倒入陶瓷锅，并立即将玻片放入其中，确保玻片完全浸入水中，盖好盒盖，在 （约 ）高压处理 ，自然冷却至 以下取出。在中洗 次，洗最后一遍时配制好双氧水甲醇溶液。将玻片完全浸入双氧水甲醇溶液中室温处理。在中洗 次。如果正常猪血清是冷冻的，
16、则需要提前取出化冻，用前 配制好。在玻片的组织上滴满正常猪血清，置湿盒中轻轻盖上盖子，室温作用 。同时，取出犌犅犜 冷冻的一抗进行化冻，并配制好工作液。弃去正常猪血清，用吸水纸吸干组织四周的液体。将一抗工作液滴加在组织上，确保组织完全覆盖，湿盒中 作用，或者在下作用过夜。在中洗 次，同时取出下保存的免疫组织化学显色试剂盒，使其回温至室温状态。洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体，然后在组织上滴满显色试剂盒中的标记聚合物的抗鼠二抗，湿盒中室温作用 。在中洗 次。洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体，然后在组织上滴满试剂盒中的底物显色液，确保组织完全覆盖，湿盒中室温作用 。在蒸馏水中漂洗 次。将玻片放入 氏苏木素液复染作用。在蒸馏水中漂洗。用水溶性封片剂封片。结果判定 在阳性和阴性对照片染色结果正确的情况下，分别在倍数为 、和 的光学显微镜下观察组织玻片，进行结果判定。阳性结果：脑组织灰质区特别是脑闩部的迷走神经背核、孤束核和三叉神经脊束核等处出现特异性颗粒状染色，则判定为疯牛病阳性。阴性结果：脑组织灰质区未见特异性颗粒状染色，则判定为疯牛病阴性。免疫印迹方法 实验室生物安全要求见 ，但组织匀浆、
