1、I CS 0 7.1 0 0.3 0C 5 3(G8中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 9 9 1 5.7-2 0 0 5猪链球菌 2型荧光 P C R检测方法Me t h o d o f t h e r e a l-t i m e P C R f o r t h e d e t e c t i o n o f S t r e p t o c o c c u s s u i s t y p e 22 0 0 5-0 9-2 7 发布2 0 0 5-1 1-0 1 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布GB/T 1 9
2、 91 5.7-2 0 0 5月 叨青本标准的附录A是规范性附录，附录 B是资料性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国兽医药品监察所。本标准主要起草人:张鹤晓、宋立、高志强、宁宜宝、乔彩霞、王甲正、杨承槐、吴丹、谷强。本标准系首次发布的国家标准。GB/T 1 9 9 1 5.7-2 0 0 5猪链球菌 2 型荧光 P C R检测方法 1 范围 本标准规定了猪链球菌 2 型荧光 P C R检测方法。本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪链球菌 2 型的检测。2 规范性引用文件
3、 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 1 9 4 3 8.1-2 0 0 4 禽流感病毒通用荧光 R T-P C R检测方法3缩略语 本标准采用下列缩略语:荧光P C R荧光聚合酶链反应 C t 值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环圈数 D NA脱氧核糖核酸 T a q 酶T a q D NA聚合酶 P B S磷酸盐缓冲生理盐水4原理 采用 T a
4、 g Ma n方法，在比对猪链球菌2型英膜抗原2 J 基因(c p s 2 J)序列的基础上，设计针对该基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5 端标记F A M荧光素为报告荧光基团(用R表 示),3 端标记T A M R A荧光素为淬灭荧光基团(用Q表示)，它在近距离内能吸收5 端荧光基团发出的荧光信号。P C R反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上 R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检 测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时，T a q 酶的5-3 的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的 R基团游离出来，所发出的荧光不再为 Q所吸收而被检
5、测仪所接收。随着P C R反应的循环进行，P C R产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5 猪链球菌 2 型荧光 P C R检测实验室的标准化设里与管理 猪链球菌2型荧光 P C R检测实验室的标准化设置与管理见 G B/T 1 9 4 3 8.1-2 0 0 4中附录 C,6 试荆和材料6.1 试 剂 除另有说明，所用试剂均为分析纯。6.1.1 无水乙醇:-2 0预冷。6.1.2 7 5%乙醇:用新开启的无水乙醇和无 D N A酶的灭菌纯化水配制，-2 0预冷。6.1.3 0.0 1 mo l/L p H9.2的P B S:配方见附录A,02 1 士2)0 C,1 5 mi n 高压灭菌冷却。
6、GB/T 1 9 9 1 5.7-2 0 0 56.1.4 猪链球菌 2 型荧光 P C R检测试剂盒1):试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B.6.2 仪器设备6.2.1 高速台式冷冻离心机:最大转速 1 3 0 0 0 r/m i n以上。6.2.2 荧光P C R 检测仪、计算机。6.2.3 2 0C-8冰箱和一2 0冰箱。6.2.4 微量移液器:0.5 p L-1 0 p L,5 p L-2 0 p L,2 0 p L -2 0 0 p L,2 0 0 K L-1 0 0 0 p L.62.5 组织匀浆器。6.26 混匀器。样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样
7、品前处理过程中须戴一次性手套。7.1 取样工具7.1.1 棉拭子、剪刀、镊子、研钵、E p p e n d o r f 管。7.1.2 所有上述取样工具必须经(1 2 1 士2)C,1 5 mi n高压灭菌并烘干或经 1 6 0干烤 2 h.7.2 采样方法7.2.1 生猪拭子样品 咽喉拭子采样，采样时要将拭子深人喉头及上愕来回刮3次一5 次，取咽喉分泌液。7.2.2 扁桃体、内脏或肌肉样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 1.0 g于研钵中充分研磨，再加 5.0 m L P B S混匀，然后将组织悬液转人无菌E p p e n d o r f 管中，编号备用。7.2.3 血清或血浆 用无菌注
8、射器直接吸取至无菌 E p p e n d o r f 管中，编号备用。7.3 存放与运送 采集或处理的样本在 2*C-8条件下保存应不超过 2 4 h;若需长期保存，须放置一7 0冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融 3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验 室。操作方法8.飞 样本核酸的提取 在样本处理区进行。8.1.1 提取方法 18.1.1.1 取n 个 1.5 m L灭菌E p p e n d o r f 管，其中n 为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。8.1.1.2 每管加人 1.0 m L裂解液，然后分别加人待测样本、阴性对
9、照和阳性对照各 1 0 0 p L，一份样本换用一个吸头;混匀器上震荡混匀5 s。于4 0C-2 5 条件下，1 0 0 0 0 r/m i n 离心1 0 m i n,8.1.1.3 取与8.1.1.1中相同数量的 1.5 mL灭菌 E p p e n d o r f 管，加人 5 0 0 I L无水乙醇(-2 0预冷)，对每个管进行编号。吸取 8.1.1.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液要充分吸取，不要吸出底部沉淀，颠倒混匀。8.1.1.4 于4*C-2 5 条件下，5 0 0 0 r/m i n 离心5 m i n(E p p e n d o r f 管开口 保持朝离心机转
10、轴方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加人 1.0 mL 1)由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。GB/T 1 9 91 5.7-2 0 0 57 5%乙 醇，颠倒洗涤。8.1.1.5 于4 C-2 5 条件下，5 0 0 0 r/mi n离心 1 0 mi n(E p p e n d o r f 管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干.8.1.1.6 4 0 0 0 r/m i n
11、离心 1 0s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5 s-1 5 s。不宜过于干 燥，以 免D N A不溶。8.1.1.7 加人 1 1 p L无 D NA酶的灭菌纯化水，轻轻混匀，溶解管壁上的D N A,2 0 0 0 r/m i n离心 5 s,冰上保存备用。8.1.2 提取方法28.1.2.1 取 二个 1.5 mL灭菌E p p e n d o r f 管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。8.1.2.2 每管加人1 0 0 p L D NA提取液 1，然后分别加人待测样
12、本、阴性对照和阳性对照各 1 0 0 p L，一份样本换用一个吸头，混匀器上震荡混匀5 s，于4 0C-2 5 条件下，1 3 0 0 0 r/m i n 离心1 0 m i n e8.1.2.3 尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加人 1 0 p L D N A提取液 2,混匀器上震荡混匀 5s。于4-2 5 条件下，2 0 0 0 r/mi n离心 1 0 s e8.1.2.4 1 0 0干浴或沸水浴 1 0 mi n;加人4 0 p L无 D NA酶的灭菌纯化水，1 3 0 0 0 r/min离心1 0 mi n,上清即为提取的D NA，冰上保存备用。8.1.3 D N A 提取后的处理要求
13、提取的D NA须在 2h内进行 P C R扩增或放置于一7 0冰箱。8.2 扩增试剂准备与配制 在反应混合物配制区进行。从试剂盒中 取出猪链球菌2 型荧光P C R反应液、T a q 酶，在室温下融化后，2 0 0 0 r/m i n 离心5 s,设所需 P C R数为 n，其中 n 为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需使用 1 5 p L P C R反应液及0.3 1,L T a q酶。计算各试剂的使用量，加人一适当体积试管中，向每个 P C R管中各分装 1 5 K L，转移至样本处理区。8.3加样 在样本处理区 进行。在各 设定的P C R管中分别加人8.1.
14、1.7 或者8.1.2.4 中制备的D N A溶液1 0 I L，使总体积达 2 5 I L。盖紧管盖后，5 0 0 r/mi n 离心 3 0 s,8.4 荧光P C R反应 在检测区进行。将 8.3中加样后的P C R管放人荧光 P C R检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置:第 一阶 段，预 变 性9 2 3 m i n;第二阶段，9 2 5 s,6 0 3 0 s,4 5 个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时 进行。结 果判定9.1 结果分析条件设定 读取检测结果。闹值设定原则以阑值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整9.2 质
15、控标准9.2.1 阴性对照无 C t 值并且无扩增曲线。9.2.2 阳性对照的 C:值应(3 0.0，并出现特定的扩增曲线。9.2.3 如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。GB/T 1 9 9 1 5.7-2 0 0 59.3 结果描述及判定9.3.1 阴性 无 C t 值并且无扩增曲线，表明样品中无猪链球菌 2 型。9.3.2 阳性 C t 值镇3 0.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪链球菌 2 型。GB/T 1 9 9 1 5.7-2 0 0 5 附录A (规范性附录)磷酸盐缓冲生理盐水配方A.1 A液(0.2 mo l/L磷酸二氮钠水溶液)一水合磷酸二氢钠(N
16、a H2 P O,H2 0)2 7.6 g,溶于蒸馏水中，最后稀释至 1 0 0 0 mL.A.2 B液(0.2 m o l/L磷酸氮二钠水溶液)七水合磷酸氢二钠(Na,HP 0,7 H2 0)5 3.6 g,或十二水合磷酸氢二钠(N a 2 HP 0,1 2 H2 0)7 1.6 g 或二水合磷酸氢二钠(N a,H P O,2 H,0)3 5.6 g 加蒸馏水溶解，最后稀释至 1 O O O m L.A.3 0.0 1 mo l/L,p H7.2磷酸盐缓冲生理盐水的配制0.2 mo l/L A 液1 4 mL0.2 mo l/L B液3 6 mL氯化钠8.5 g用蒸馏水稀释至 1 0 0 0 mL eGB/T 1 9 9 1 5.7-2 0 0 5 附录B (资料性附录)猪链球菌 2型荧光 P CR试 剂盒组成、说朋及使用时的注意事项B.1 试剂盒的组成试剂盒的组成见表 B.1,表 B.1 猪链球菌2型荧光P C R试剂盒组成组成(4 8 t e s t s/盒)数量裂解液(提取方法 1)或D NA提取液 1(提取方法2),D NA提取液 2(提取方法 2)4 8 mL X 1 盒(
