1、I1Cs65.020.01B16中华人民共和国国家标准GB/T28066-2011丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法Detection and identification of Pseudomonas syringaepv.pisi(Sackett)Young et al.2011-12-30发布2012-06-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T28066-20116病菌分离6.1种子样品的制备检查皱缩种子和其他为害状的种子。每份种子检测样品至少检测2000粒种子。将种子倒入5L桶内，加3L无菌水，搅拌，用无菌（新）的塑料袋严密封盖，4下静置
2、16h18h或过夜；去掉塑料袋，充分搅拌。取种子浸出液10mL,用15000g离心5min,用蒸馏水分2次（每次1mL)洗下沉淀物，制成种子浸出液，以备分离培养。6.2种子中病菌的分离培养取100L的种子浸出液涂布于P3和（或）S4培养基平板上（培养基配制见附录B)。每个样品设3个10个重复，无菌水作为空白对照。在25士2下黑暗中培养，3d后开始观察。如果在培养基上产生可疑菌落（菌落特征见表1），则将菌落转移至KB平板上划线培养1d2d进行纯化（培养基配制见附录B),纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定。表1培养基上的菌落特征P3培养基S4培养基Pspi的菌落扁平状，白
3、色、透明，边缘不规则Psp的菌落较大，半球形，白色，边缘整齐多数菌株有蓝色荧光6.3植物组织中病菌的分离培养仔细检查植物叶片、豆荚等组织的症状（参见图A.1),用无菌刀片将可疑的病斑切成细的切块，加一滴无菌水，置于载玻片上，盖上盖玻片后在显微镜下观察。如果观察到细菌的菌脓，则进行分离培养。选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织，切取病斑前沿部分2mm7mm的组织，用70%酒精表面消毒15s,无菌水洗2次3次，在S4和（或）P3培养基平板上划线分离。在25土2下黑暗中培养3d后，开始观察。如果在培养基上产生可疑菌落（菌落特征见表1），则将菌落转移至KB平板上培养1d2d进行纯化，纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定。7病菌鉴定7.1生化鉴定采用BIOLOG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定。7.2 DAS-ELISA方法将可疑菌落配制成10CFU/mL悬浮液，取100uL悬浮液作为检测样品。每个检测样品重复一次。用已知菌株作阳性对照，用缓冲液作空白对照。具体操作步骤见附录C。2
