1、ICs 67.040X 0 4中华河彳侈冖F人 民 共 和国 国 家 标GB/T9695.3-2009准肉与 肉制品氯霉素含量的测定Meat and meat products-Determination of chloramphenicol content2009-04-08发布2009-05-01 实施中华人民共和国国家质量监督检验检痦家垦 发布中 国 国 家 标 准 化 管 理GB/T9695.32-2009目 刂 舀本标准制定过程 中参考了“欧盟食品分析方法CY3.6”。本标准的附录为资料性附录。本标准 由全国肉禽蛋制品标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位:中 国肉类食品综合研究
2、 中心、中国商业联合会商业标准中心、武汉市疾病预防控制中心、江阴市产品质量监督所、厦门市疾病预防控制中心。本标准主要起草人:宋永青、赵榕、梁高道、郭文萍、吴东雷、骆和东、靳晓蕾、刘振宇。GB/T9695.32-2009肉与肉制品 氯 霉素含量的测定1 范围本标准规定 了畜禽 肉中氯霉素的测定方法。本标准适用于畜禽 肉中氯霉素的测定。本标准检 出限:气相色谱-质谱法,检 出限为0.2u g/k g;酶联免疫法为0.05u g/k g。2 规范性引用文件下列文件 中的条款通过GB/T9695本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注 日期 的引用文件,其随后所有的修改单(不 包括勘误的内容)或 修订版
3、均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日期的引用文件,其最新版本适用于本部分。G B/T 6 6 8 2 分析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法(G B/T 6 6 8 2 0 8,I S O 3 6 9 6:1 9 8 7,M O D)GB/T9695.19 肉与肉制品 取样方法3 气相色谱-质谱法(确 证法)3.1 原理样品中氯霉素用 乙酸乙酯提取,脂 肪用正 己烷去除,经 C1:净化,BSTFA+TMCS(99+D衍生后,用NCI源选择印/z 为466的特征离子为 目标离子,在 SIM模式下进行GC MS测定。3,2
4、 试剂和材料若无特别说明,所用试剂均为分析纯,所用水应符合GB/T6682的要求。3.2.1 氯霉素:标准品,纯度99%。3.2.2 甲醇:色谱纯。3.2.3 三氯甲烷。3.2.4 正己烷:色谱纯。3.2.5 乙酸乙酯。3.2.6 无水硫酸钠。3.2.7 氯化钠。3.2.8 N、O双三 甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTF)。3.2.9 三甲基氯硅烷(T M C S)。3.2.1 0 丙酮:色谱纯。3.2.l l 甲苯。3.2.1 2 甲醇溶液:甲醇+水=2+8。3.2.1 3 氯化钠溶液(1 0 酽L):称取4.0 0 g氯化钠(3.2.7.7),用水溶解,定容至1 0 0 mL。3.2.1 0 甲
5、醇一氯化钠溶液:量取甲醇溶液(3.2.1 2)2 0 mL、氯化钠溶液(3.2.1 3)8 0 mL,混匀。3.2.15 混合衍生剂:N、O双三 甲基硅烷二氟乙酰胺+三甲基氯硅烷=99+1。3.2.16 氯霉素标准储备溶液(c=0.1m g/m L):称取氯霉素标准品0.01g(精确至0.0001g),用丙酮溶解并定容至100m L。储备液贮存在4冰箱 中,可使用两个月。3.2.17 氯霉素标准工作溶液:根据试验需要,用丙酮(2.2.10)稀释标准储备溶液(2.2.17),配成适 当浓度的标准工作溶液。GB/T9695,32-20093.3 仪器设备实验室常规设备及下列仪器。3.3.1 气相色
6、谱-质谱联用仪(GMS)。3.3.2 分析天平:可准确称重至0.0 0 0 1 g。3.3.3 分析天平:可准确称重至0.0 1 g。3.3.4 离心机:5 5 0 0 r/m i n。3.3.5 涡旋仪。3.3.6 同相萃取装置。3.3.7 旋转蒸发仪。3.3.8 均质器。3.3,9 振荡器。3.3,10 机械设备:用 于试样 的均质。包括:绞 肉机、斩拌机等肉类组织粉碎机。3,3.1 l 氮吹仪。3.3.I 2 具塞离心管:5 0 mL、1 0 mL。3.3.1 3 C】:固相萃取柱或相当者:0 mg,3 mL。3.4 分析步骤3.4.1 试样液制备3.4.1.1 试样的制备按GB/T96
7、95.19规定 的方法取样。至少取有代表性的试样200g,使用适当的机械设备(3.3.10)将试样均质。均质后 的试样尽快分析,否则,应密封低温贮存,防 止试样变质或成分发生变化。贮存 的试样在启用时,应重新混匀。3.4.1.2 提取称取10g 样品(精 确至0.01g)置于50m L具塞离心管中,加 人少量无水硫酸钠和30m L乙酸乙酯均质1m i n,以5000m i n 离心 5m i n 后,用 吸管吸出上层乙酸乙酯于浓缩瓶 中,残 渣再加入 乙酸乙酯15m L重复提取样品,合并提取液。提取液在50水浴 中旋转蒸发,除 去 乙酸 乙酯,加 入l m L甲醇-氯化钠溶液(3.2.1犭)和
8、 4m L正己烷,充分振摇后,转移至10m L具塞离心管中,用1m L甲醇-氯化钠溶液(3.2.14)清洗浓缩瓶,合 并清洗液于10m L具塞离心管中。涡旋0.5m i n,经3000r/m i n 离心3m i n 后,用吸管吸去正 己烷,加人4m L正己烷重复上述操作。然后在离心管 中加人犭m I冫 乙酸乙酯,涡旋1m l r l,经3000r/m i n 离心 3m i n 后,用吸管吸出乙酸乙酯,加入亻m L乙酸乙酯重复上述操作,合并乙酸乙酯于浓缩瓶 中,在 50水浴中旋转浓缩至近干,用5m L水溶解残渣。3.4.1.3 净化依次用5m L甲醇、5m L三氯 甲烷、5m L甲醇、5m
9、L水活化C1:固相萃取柱(3.3.14),然后加人上述步骤得到的提取液,加 5m L甲醇+水(3.2.12)淋洗色谱柱,用25m L甲醇洗脱于浓缩瓶 中,洗脱液在50下浓缩至近干。用100u L甲醇溶解残渣,并 转移至10m L具塞离心管 中,再 用 甲醇 冲洗浓缩瓶,合并洗液,于 50下用氮气吹干。3.4.1.4 衍生化于吹干的试样残渣中加人100u L甲苯和100u L混合衍生剂(3,2.15),盖紧塞后,涡旋混匀1m i n,60下反应30m i n,然后在50下用氮气吹干,加入1m I正己烷溶解残渣。3.4.2 标准工作液制备配制好的标准工作液按3.4.1.4步骤进行操作。3.4.3
10、空白液制备除不称取试样外,均按3.4.1步骤进行操作。2CB/T9695.32一20093.4,4 测定3.4.4.l 气相 色谱-质谱 法测定 条件色 谱 柱:D 5 M S(3 0 m 0.2 5 m m 0.2 5 u m)石英 毛 细 管 柱 或 相 当 者;载气:氦气,纯度99.999%;流速:1,6 5 mL/min;进样口温度:250;进 样 量:1 u L;进样方式:无分流(保 持1m i n)进样;柱温程序:初始5 5,保持1 min,以2 5/min速度升至2 8 0,保持6 min;NCI源:70e V;离子源温度:150;接口温 度:2 8 0;溶剂延迟:7 min;反
11、应气:甲烷,纯度99.99%;选择离子检测:保 留时问/m i n 目标物 检测离子狃/z12.58 CPTMS 466,饣68,376,3783.4.4.2 定性 测 定进行样品测定时,如果检出的色谱峰保 留时间与标准样品相一致,并且在扣除背景后的样品质谱图中,所选择 的离子均出现,而且所选择的离子 比与标准样品衍生物的离子 比相一致(各 相关离子 比在相关标准品的1O%之内),则 可判断样品中存在氯霉素。3.4.4.3 定量测定吸取1u I冫衍生的试样液、标准液或空 白液注入气相色谱-质谱联用仪 中,以 仍/z 466为定量离子,标准工作液中氯霉素的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲
12、线。根据试样液 的峰面积,从 标准曲线上查出溶液中对应的氯霉素浓度值。用标准工作 曲线对试样进行定量,样 品溶液 中氯霉素衍生物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下,氯霉素衍生物的参考保 留时问为12.58m i n。氯霉素标准物质衍生物总离子流图和质谱图以及氯霉素标准物质衍生物选择离子质谱图参见附录A中的图.1、图.2、图A.3。3.4.5 平行试验按 以上步骤,对 同一试样进行平行试验测定。3.5 结果计算按式(1)计算样品中氯霉素的含量:X=(O叨式 中:X 一试样屮氯霉素的含量,单位为微克每千克(u 酽 k g);c 一从标准工作曲线上查得试样液 中氯霉素的浓度,单位为
13、纳克每毫升(n g/m L);旬一 从 标准工作曲线上查得空白液 中氯霉素的浓度,单位为纳克每毫升(n g/m D;V-试样定容体积,单位为毫升(m I);9P9 一称取试样 的质量,单位为克(g)。结果取算术平均值,保 留三位有效数字。3.6 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。GB/T9695.32-20094 酶联免疫法(ELIs A筛选法)4.1 原理采用间接竞争ELISA方法,在酶标板微孔条上包被偶联抗原,样 本 中残 留的氯霉素和微孔条上包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体,加人酶标二抗后,加 人底物显色,样本吸光值与其残 留物氯霉素的含量成负
14、相关,与标准曲线 比较再乘 以其对应的稀释倍数,即可得出样品中氯霉素的含量。4.2 试剂若无特别说明,所用试剂均为分析纯,所用水应符合GB/T6682的要求。4.2.1 乙酸乙酯。4.2.2 正己烷。4.2.3 氯霉素酶联免疫试剂盒:2 8冰箱 中保存。注:试 剂盒应选用国家有关行政管理部门各案的生产商的合格产品。4.2.3.1 酶标板:8 孔1 2 条,包被有偶联抗原。4.2.3.2 氯霉素系列标准液:0 ug/L、0.0 5 ug/L、0.1 5 ug/I 、0.4 5 uyL、1.3 5 ug/L、4.0 5 ug/L。4.2.3.3 酶标二抗。4.2.3.4 抗体工作液。4.2.3.5
15、 底物液(液)。4,2.3.6 底物液(B 液)。4.2.3.7 终止液。4.2.3.8 洗涤液(浓 缩液)。4.2.3.9 复溶液(浓 缩液)。4.2.3.1 0 复溶工作液:将浓缩复溶液mI 用水稀释至dO mL。4.2.3.i1 洗涤工作液:将浓缩洗涤液厶0 mL 用水稀释至8 0 0 mL。4,3 仪器设备实验室常规设备及下列仪器。4.3.l 酶标仪:配备4 5 0 nm、6 3 0 nm滤光片。4,3.2 微量移液器:单道2 0 uL 2 0 0 uL、1 0 0 uL 1 0 0 0 uI ,多道2 5 0 uL。4.3.3 恒温箱。4.3.4 离心管:5 0 mI 冫。4,4 分
16、析 步骤4.4.1 样本 制备样本用均质器 均质后,称 取3.Og 0.05g 至50m L离心管 中,加 人 6m L乙酸 乙酯(4.2.1),用振荡器振荡1 0 min,于室温(2 0 2 5)、5 5 0 0 min离心1 0 min,移取4 mL 上层有机相至1 0 mL 干净的玻璃试管中,于5 0 6 0 水浴氮气流下吹干,加人1 mL 正己烷(厶。2.2),用涡旋仪涡动3 0 s,再加1 mL 复溶工作液(2.3.1 0),用涡旋仪涡动1 min,于室温(2 0 2 5)、5 5 0 0 min离心1 5 min;除去上层有机相,取下层1 0 0 uI 用于分析。稀释倍数为0.5 倍。4.4.2 空白对照样本取空 白试样,按 4.厶.1步骤进行操作。4,4.3 测定步骤4.4,3.1 微孔板及试 剂 的准备:从 冷藏环境 中取 出需要数量 的微孔板 和其他所需试剂,置 于室 温(20 25)平衡30m i n 以上,并将不用的微孔板放入 自封袋中,保存于2 8。4,4.3,2 编号:将样本、标准品、空 白对照样本对应微孔按序编号,记 录样本孔、标准孔和空 白样本孔所在的位置
