1、农业部2122号公告一9-2014转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米DAS-40278-9及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了转基因耐除草剂玉米DAS402789转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因耐除草剂玉米DAS40278-9及其衍生品种，以及制品中DAS40278-9转化体成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法农业部1485号公告一4一2010转基因植物及其产品成分
2、检测DNA提取和纯化农业部1861号公告一3一2012转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性PR方法农业部2031号公告一19一2013转基因植物及其产品成分检测抽样NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1zSSIIb基因zSSIIb gene编码玉米淀粉合酶异构体STS-2的基因，在本文件中作为玉米的内标准基因。3.2DAS40278-9转化体特异性序列event-specific sequence of DAS40278-9DAS402789外源插入片段5端与玉米基因组的连接区序列，包括玉米基因组序列与转化载体部分序列。4原理根据转基
3、因耐除草剂玉米DAS402789转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期的DNA片段，判断样品中是否含有DAS40278-9转化体成分。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.1琼脂糖。5.210g/L溴化乙锭溶液：称取1.0g溴化乙锭(EB),溶解于100mL水中，避光保存。警告一溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.310mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠(NaOH),溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。1农业部2122号公告一9一201
4、4按NY/T672和农业部2031号公告一19一2013的规定执行。7.2试样制备按NY/T672和农业部2031号公告一19-2013的规定执行。7.3试样预处理按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.4DNA模板制备按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.5PCR反应7.5.1试样PCR反应7.5.1.1玉米内标准基因PCR反应按农业部1861号公告一3一2012的规定执行。7.5.1.2转化体特异性序列PCR反应7.5.1.2.1每个试样PCR反应设置3次平行。7.5.1.2.2在PC反应管中按表1依次加入反应试剂，混匀，再加25L石蜡油（有热盖功能的PCR仪可不
5、加)。也可采用经验证的、等效的定性PCR反应试剂盒配制反应体系。表1PCR检测反应体系试剂终浓度体积水10PCR缓冲液12.5L25mmol/L氯化镁溶液1.5 mmol/L1.5LdNTPs混合溶液（各2.5mmol/L)各0.2mmol/L2.0L10 umol/L DAS-40278-9-F0.2 umol/L0.5L10 umol/L DAS-40278-9-R0.2 gmol/L0.5LTaq DNA聚合酶0.025U/L25mg/LDNA模板2 mg/L2.0L总体积25.0L“一”表示体积不确定。如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液。根据TqD小NA聚合酶的浓度确定其体
6、积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0L。7.5.1.2.3将PCR管放在离心机上，500g3000g离心10s,然后取出PCR管，放人PCR仪中。7.5.1.2.4进行PCR反应。反应程序为：94变性5min;94变性30s,56退火30s,72延伸30s,共进行35次循环；72延伸7min。7.5.1.2.5反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。7.5.2对照PCR反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因玉米基因组DNA作为阴性对照；以转基因玉米DAS40278-9质量分数为0.1%1.0%的玉米基因组DNA,或采用DAS40278-9转化体特异性序列与非转基因玉米基因组相比的拷贝数分数为0.1%1.0%的DNA溶液作为阳性对照；以水作为空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与7.5.1.1和7.5.1.2相同。7.6PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加人5LEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放人1XTAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12LPC产物与3L加样缓冲液混合3
