1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 522420192019-12-27 发布2020-07-01 实施中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署发 布ICS 07.100.30X04出口食品中单核细胞增生李斯特菌检验方法实时荧光 PCR 内标法Detection of Listeria monocytogenes in food for exportReal-time PCR with internal amplification control methodISN/T 52242019前 言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则进行起草。本标准由中华人民共和国海关总署
2、会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国杭州海关、上海交通大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：李可、施春雷、王娉、史贤明、方莹、张晓峰、崔妍。1SN/T 52242019出口食品中单核细胞增生李斯特菌检验方法 实时荧光 PCR 内标法1范围本标准规定了出口食品中单核细胞增生李斯特菌的实时荧光 PCR 内标方法。本标准适用于出口食品中单核细胞增生李斯特菌的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.30-2016 食品安全国家标
3、准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室 生物安全通用要求GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3定义、术语和缩略语下列定义、术语和缩略语适用于本文件。3.1定义和术语3.1.1 扩增内标 internal amplification control，IAC扩增内标（）是指添加到 PCR 反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建 DNA 序列或者是一段致病菌的看家基因序列。主要原理是：在荧光定量 PCR 中使用与目的基因相似的扩增内标，它的两端引物结合序列与目的基因完全一致，但具有不同的探针
4、结合序列，使之不能与目的基因的探针结合，只能与内标探针结合。将扩增内标添加到 PCR 反应体系中，使之与目标基因序列共同进行扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目标序列的扩增都将受到抑制，从而达到指示 PCR 反应假阴性的目的。3.1.2 Ct值 cycle threshold Ct每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.2缩略语PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链反应。DNA（deoxyibonuleic acid）：脱氧核糖核酸。FAM（6-carboxyfluorescein）：6-羧基荧光素。HEX（6-hexachl
5、orofluorescein）：6-羧基-2，4，4，5，7，7-六氯荧光素琥珀酰亚胺酯。2SN/T 522420194方法提要荧光 PCR 反应体系中，预先加入能同时扩增目标片段和扩增内标的引物，以及目标菌探针、内标检测探针以及内标质粒，然后将样品 DNA 加入 PCR 反应液中进行两步法荧光 PCR 反应，在扩增内标质粒与样品 DNA 的共同扩增中如果存在抑制现象，扩增内标的 PCR 扩增也将被抑制，从而达到对样品的荧光 PCR 检测过程进行假阴性监控目的。5试剂除另有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容
6、器分装。5.1DNA 提取试剂：DNA 提取液：20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，1.2%Triton X-100（pH 8.0），也可使用商业化的 DNA 提取试剂。5.2Taq DNA 聚合酶。5.3dNTP 混合液。5.410PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.4），200mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2。5.5引物和探针：见附录 A。5.6内标质粒：参见附录 B。6主要仪器和设备6.1恒温水浴锅或加热套装置：100。6.2恒温培养箱：36 1，30 1。6.3离心机：最大转速 13 000 r/min 以
7、上。6.4天平：感量 0.1 g。6.5冰箱：-20 4。6.6均质器。6.7可调移液器：1 L-1000 L。6.8荧光 PCR 仪。7检验程序食品中单核细胞增生李斯特菌的扩增内标荧光 PCR 检测流程见图 1。图 1 食品中单核细胞增生李斯特菌检验程序3SN/T 522420198操作步骤8.1 样品制备、增菌培养按照 GB 4789.30-2016 中第一法进行样品制备和增菌（两次增菌）。8.2 细菌模板 DNA 的制备取 8.1 中培养的二次增菌液 1 mL，加到 1.5 mL 无菌离心管中，8 000 r/min 离心 5 min，吸弃上清液；加入 50 L DNA 提取液（使用前室
8、温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴 10 min，置冰上 10 min；12000 r/min 离心 5 min，取上清保存于-20备用以待检测。也可采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒并按其说明制备模板 DNA。8.3 荧光 PCR 检测8.3.1 荧光 PCR 反应体系荧光PCR反应所用引物和探针见附录A，PCR反应体系见表1。也可采用商品化的PCR扩增体系。每个 DNA 样品做 2 个平行管。加样时应使样品 DNA 溶液完全落入反应液中，不要粘附于壁上，加样后尽快盖紧管盖。表 1 PCR 反应体系组分工作液浓度加样量 L终浓度10PCR 缓冲液-2-dNTP Mixture（10
9、 mmol/L）10 mol/L1.6-引物（上游）10 mol/L0.4200 nmol/L引物（下游）10 mol/L0.4200 nmol/L单核细胞增生李斯特菌探针10 mol/L0.6300 nmol/L内标质粒探针10 mol/L0.6300 nmol/LTaq DNA 聚合酶5 U/uL0.40.1 U/uLDNA 模板-1-内标质粒1去离子水-补至 20-8.3.2 阳性对照、阴性对照和空白对照设置检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照采用含有检测序列的DNA（或质粒）和 IAC 片段同时作为荧光 PCR 反应的模板，阴性对照采用含 IAC 片段的质粒作为荧光
10、PCR 反应的模板，空白对照用无菌水作为荧光 PCR 反应的模板。8.3.3 荧光 PCR 反应程序荧光 PCR 反应循环参数为 95 4 min；95 5 s，65 20 s，45 个循环。信号采集设为 FAM、HEX 荧光素（FAM 荧光素代表样品中单核细胞增生李斯特菌信号，HEX 荧光素代表扩增内标信号）。注：因不同 PCR 仪的性能差异，可通过条件优化适当调整 PCR 循环的退火温度及时间。4SN/T 522420199荧光阈值的确定PCR 反应完成后应设定荧光阈值以分析样品的 Ct 值，以 PCR 反应的前 3 个 15 个循环的荧光信号作为基线信号（噪音），荧光阈值理论上定义为基线
11、信号的标准偏差的 10 倍，在实际应用中可以根据仪器基线信号进行人工调整，设定原则是以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且不出现 Ct 值为准。10结果及判断10.1质控标准质控标准如下：空白对照：FAM 荧光素和 HEX 荧光素均无扩增曲线，Ct 40.0；阴性对照：FAM 荧光素无扩增曲线，Ct 40.0；HEX 荧光素出现典型的扩增曲线，Ct值应35.0；阳性对照：FAM 荧光素出现典型的扩增曲线，Ct值应 35.0，而 40，建议样本重做，再次扩增后的结果 Ct 值如果仍小于 40，并有典型的扩增曲线，且对照结果均正常，则可判定该基因为阳性。对于阳性结果
12、，应对样品的二次增菌液或可疑纯菌落进一步按 GB 4789.30 中第一法操作步骤进行确认后报告结果。11生物安全和防污染措施11.1生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行操作，所有培养物和废弃物应参照GB 19489 中的有关规定。11.2防污染措施防污染措施应符合 GB/T 27403 的规定。5SN/T 52242019附 录 A（规范性附录）荧光 PCR 所用引物和探针A.1 单核细胞增生李斯特菌检测所用引物、探针和内标序列检测探针见表 A.1，单核细胞增生李斯特菌探针 5 端为 FAM 标记，3 端为 ECLIPCE 标记，内标序列探针 5 端为 HEX 标
13、记，3 端为ECLIPCE 标记。表 A.1 单核细胞增生李斯特菌检测所用引物和探针单核细胞增生李斯特菌引物上游引物：5-CATGGCACCACCAGCATC-3下游引物：5-CATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3单核细胞增生李斯特菌探针5-FAM-CCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAECLIPCE-3内标探针5-HEX-ATAGGAGCACTCGCCGCCCACATCECLIPCE-36SN/T 52242019附 录 B（资料性附录）内标质粒的制备B.1 备样人工合成一段 65 bp 的 IAC 序列（5-CATGGCACCACCAGCATCTATAGGAGCACTCGC
14、CGCCCACATCATCGAAAAGAAACACGCGGATG-3），将此片段连接至 pMD 19-T、pMD 18-T 等质粒载体上备用。具体制备过程如下。B.2 扩增内标序列与载体连接取 3 l 合成 IAC 片段与 pMD 19-T、pMD 18-T 等质粒载体（T/A-type PCR cloning vector）在 0.5 ml 离心管中进行连接，反应体系为：Ligation Solution I 5 LpMD18-T 载体（30 ng/l）1 LPCR 产物 3 LH2O 1 L总体积 10 L16水浴 8 h，将连接后的质粒转化感受态大肠杆菌。B.3 感受态细胞的制备B.3.
15、1 以无菌接种环取保存的 E.coli TG1 菌株于 LB 琼脂平板划线，37培养。B.3.2 挑取LB琼脂平板上的大肠杆菌TG1单菌落，接入5 mL LB液体培养基中，37摇床培养12 h。B.3.3 按 1%接种量将大肠杆菌过夜培养物转接入 50 mL LB 中，37摇床培养至 OD600 值约为 0.6，置于冰中冷却 10 min。B.3.4 在4，6000 r/min条件下离心5 min，倒去上清液，将细胞重悬于预冷的10 mL 0.1M CaCl2中，在冰上放置 20 min 以上。B.3.5 在 4，6000 r/min 条件下离心 5 min，去上清，细胞重新悬浮于 2 mL
16、预冷的含有 15%甘油的 0.1 M CaCl2中，分装成 100 L 的小份，于 70保存或直接用于转化。B.4 连接产物的转化制备抗性平皿，在装有约 100 L 感受态细胞的 1.5 mL 离心管中加入连接产物 10 L，轻轻混匀于冰上放置 30 min 后，42水浴中热击 90 s，热击后迅速置于冰上冷却 2 min。向管中加入 400 L LB液。体培养基（不含 Amp），37 200 r/min-220 r/min 振荡培养 1 h,取 100 L 菌液涂布合适的抗性平板，37培养 16 h-18 h，观察单菌落的出现。如进行蓝/白斑筛选，则于转化前约 2 h 在 LB 平板上避光涂布 40 L X-gal（20 mg/mL）和 80 L IPTG（10 mg/mL），正放平皿于 37温箱中，使 X-gal和 IPTG 充分吸入琼脂中，然后如上用菌液涂布平板。B.5 阳性转化子的筛选用灭过菌的牙签挑取转化的单菌落，点种于相应的氨苄抗性平板后将牙签上菌体加入含 PCR 反7SN/T 52242019应液的 PCR 管中并编号，经相应检测引物的 PCR 扩增后，在 1.5%琼脂糖
