1、SN中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 4 2 3 一 9 5出口冻兔肉中“兔出血症”病毒 检测方法D e t e c t i o n me t h o d o n r a b b i t h a e mo r r h a g i c d i s e a s e v i r u s f r o m e x p o r t i n g f r o z e n r a b b i t s1 9 9 5 一 0 9 一 2 0 发布1 9 9 6 一 0 1 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出 口商品检验局发 布中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口冻兔肉中“兔出血症”病毒 检测方
2、法S N 0 423 一 95De t e c t i o n me t h o d o n r a b b i t h a e mo r r h a g ic d i s e a s e v i r u s f r o m e x p o r t i n g f r o z e n r a b b i t s1 主题内容与适用范围 本标准规定了出口冻兔肉中“兔出血症”病毒检测样品的采集、检测方法和结果判断等。本标准适用于出口冻兔肉中“兔出血症”病毒的检测。2 术语 “兔出血症”又称兔病毒性出血症，是兔的一种急性病毒性传染病，该病潜伏期短，发病快，死亡率高，流行范围广，是由一种新的病毒引起的病
3、毒病，该病毒的形态呈二十面体对称的球形，直径 3 4 n m，没有囊膜，对人红细胞有凝集作用，尤其对人“O 型红细胞较为敏感，但不能凝集牛、水牛、马属动物、犬、鸭、鹤鹑和小白鼠的红细胞。3 样品采集3.1 冻带骨兔肉:每只被采集样品的免体取胫骨二支，装入干净的塑料袋内。3.2 去骨兔肉:剪取同一兔体的肌肉2 0 g,装入干净的塑料袋内，每件样品必须标记清楚(编号、名称、生产日期、采样时间、生产单位)。标签纸要防水，字迹不易褪色。样品采集后分别将每个样品袋封口，装入消毒容器内(可用铝饭盒)冷冻保存。采样工具必须经酒精火焰消毒后方能重复使用。3.3 样品保存 样品应保持冷冻状态(可在冰内、冰箱的冰
4、盒内、低温冰箱或冷库内保存)。阳性样品，发出报告后7 d 方能处理检样。器材与试剂 器材分析天平(百分之一);普通离心机;1 6 8-T G L微型高速离心机;均质器;玻璃研磨器;微型振荡器;煮沸消毒器;冰箱;中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 5-0 9-2 0 批准1 9 9 6 一 0 1 一 0 1 实施 Is N 0423 一 95 培养箱;高压消毒器;反应板清洗器;微量移液器;滴头(大，小若干);拳握式持针器;血凝反应板;酶标反应板;酶标测定仪。4.2试剂 靴酸(A.R);磷酸氢二钾(A.R);磷酸二氢钠(A.R);柠檬酸(A.R);令 日 苯二胺;3 0%双氧水;硫酸(
5、A.R);硫酸钱(A.R);辣根过氧化物酶;过碘酸钠;叠氮钠;乙二醇;聚乙二醇-6 0 0 0(P E G-6 0 0 0);三氯甲烷(A.R);氯化钠(A.R);氯化钾(A.R);吐温-8 0;牛血清白蛋白;硼氢化钠(A.R);乙酸钠(A.R);乙酸(A.R);磷酸氢二钠(A.R),4.2.1 H A,HI 试验4.2.1.1 P B(磷酸盐缓冲液):由。.1 5 mo l/L的A,B两液配成。A液:磷酸氢二 钠(N a,H P O,1 2 H 2 0)5 3.7 9 9 加蒸 馏水至1 0 0 0 m L,B液:磷酸二氢钠(N a H2 P 0,2 H,O)2 3.4 g加蒸馏水至 1 0
6、 0 0 m l-,几种常用 P B不同 p H的配合比例:p H 6.0 6.2 6.4 6.6 7.2 7.4 7.8 8.0 A液1 3 1 9 2 7 3 8 7 3 8 2 9 2 9 5 ml,B液8 7 8 1 7 3 6 2 2 7 1 8 8 5 ml,4.2.1.2 P B S(磷酸盐缓冲液):其中P B为。.0 1 mo l/L，由4.2.1.1的P B稀释 1 5 倍而成。S即为氯化钠，生理盐水浓度。4.2.1.3 生理盐水S N 042 3一 95 氯化钠8.9 g加蒸馏水至1 0 0 0 m L,4.2 门.4 1%人红血细胞悬液 新鲜人红血细胞(O型)用 2 0倍
7、量生理盐水洗涤三次，最后以 2 0 0 0 r/mi n离心 1 5 m i n，吸取压积细胞用生理盐水配成 1%悬液。4.2.2 E L I S A试验4.2.2.1 洗涤液(P B S T p H 7.4 磷酸盐缓冲液一。.5%吐温2 0):氯化钠8.0 g 磷酸氢二钾。.2 9 磷酸氢二钠2.9 9 氯化钾0.2 g 吐温-2 0 0.5 mL 加蒸馏水溶解至 1 0 0 0 mL4.2.2.2 稀释液(保温液):于P B S T内加人B S A(i 1、牛血清白蛋白)使其浓度为。.1%.4.2-2.3 底物液:0.2 mo l/L磷酸氢二钠(2 8.4 g/L)2 5.7 m L 0.
8、1 mo l/L柠檬酸(1 9.2 g/L)2 4.3 m L 蒸馏水5 0.0 m L 临用前，取上述缓冲液5 0 m L,溶解2 0 m g 邻苯二胺，再加3 0%双氧水。.0 7 5 m L,避光保存。4.2-2.4 终止液:2 m o l/L硫酸。4.2.2.5 制备与纯化I g G 取琼扩效价1:6 4 的R HD V阳性血清用 5 0%的硫酸按盐析后，再经D E 5 2 或S e p h a d e x G-2 0 0层析后可以 得到较纯化的R H D V I g G,4.2.2.6 酶标抗体的制备:取5 m g 辣根过氧化物酶溶于。.5 m L 蒸馏水中，加入新鲜配制的0.0 6
9、 m o l/L的过碘酸钠水溶液0.5 mL，混匀置冰箱3 0 mi n。取出加入乙二醇水溶液。.5 mL。于室温放置 3 0 min后加入含有 5 mg 纯化抗体的水溶液 1 m Lo 混匀并装入透析袋内，以。.0 5 mo l/L p H9.5 碳酸盐缓冲液慢慢搅拌透析 6 h(或过夜)，使之结合。然后吸出加硼氢化钠溶液(5 m g/m L)0.2 m L,置冰箱2 h,将上述混合液加人等体积饱和硫酸按溶液，冰箱放置 3 0 m i n 后离心，将所得沉淀物溶于p H 7.4P B S中 透析过夜，次日 再离心除去不溶物即得酶一 抗体结合物。用0.0 2 m o l/L p H 7.4 P
10、 B S 加置5 m L，加入 3 3.3%的甘油4C保存备用。4.2-2.7 兔出血症病毒阳性血清(R H D V阳性血清)制备:取健康兔，肌肉注射本病疫苗 1 mL。然后分别在第1 5 d,3 0 d时注射强毒1 mL,最后一次注射后 1 0天试血，当HI 效价达到 1:1 2 8时采血清即得。4.2.3 I HA、I HI 试验4.2.3.1 1%靴酸溶液。4.2.3.2 乙酸缓冲液(p H 4.3):由。.1 m o l/L乙酸 钠、乙 酸溶液按比 例配制。4.2.3.3 稀释液 在。.1 1 m o l/L p H7.2的磷酸缓冲液中加入 0.4%牛血清白蛋白，0.2 Y o 聚乙二
11、醇-6 0 0 0,1%硫柳汞。4.2.4 双醛化绵羊红细胞的致敏 以 1 mL双醛化绵羊红细胞的致敏为例:1 m L双醛化绵羊红细胞一离心，去上清一用 p H 7.4,0.0 1 m o l/L P B S洗一次一离心，去上清一加入 4.9 m L生理盐水，0.1m L1%靴酸,3 7 水浴 1 0 mi n 一离心，去上清一加入 p H4.3乙酸缓冲液S N 04 23 一 955 m L，提纯抗体 0.0 5 mL,3 7 水浴 3 0 m i n 一离心，去上清一生理盐水 5 m L洗三次一用 p H7.2,。.1 1 mo l/L P B配制成 1%血球悬液备用。检验程序耽l品样一集
12、采骨 髓 样 品 l肌 肉样 品剥 取 骨 髓 I鑫,0.01 mol/L PH7.4 PBS 5:1二玻 璃 研 磨”万 浆“节”浆。m in反复冻融三次 3 5 0 0 r/m i n离心 1 0 min取上清 加入上清液量6%的P E G-6 0 0 0”加 氯 化 钠 至 3 c$溶 解 后 置 冰 箱 过 夜4 0 0 0 r/m i n离心去上清，沉淀用少量 P B S悬浮 “所 得“悬 液 中”总 量 加 几 1/4 休 积 的 J 1 甲“摇”4 0 0 0 r/m i n离心1 0 mm取水相 验 试.1山，A S 万.L E试 验I HA,I HI 试验 判 断结 果6 操
13、作步骤6.1 试样的制备6.1.1 匀浆6.1.1.1 骨髓试样6.1.1.1.1 以持针器夹碎胫骨取出骨髓。6.1.1.1.2 装入小型塑料离心管，称重。6.1.11.3 用5 倍量的0.0 l mo l/L p H 7.4 P B S稀释。6.1.1.1.4 由玻璃研磨器研磨匀浆后装入玻璃瓶内。6.1.1.2 肌肉试样6.1.1.2.1 称重1 0 g 肌肉，加人5 0 m L 0.0 1 m o l/L p H 7.4 P B S,6.1.1.2.2 高速匀浆机匀浆 1-3 m i n，匀浆后装入三角烧瓶。6.，.2 冻融 匀浆后试样置低温冰箱内反复冻融三次后，3 5 0 0 r/m i
14、 n离心取上清。6.1.3浓缩S N 04 23一 95 在所得上清液中，加入上清液量百分之六的聚乙二醇-6 0 0 0，并加氯化钠至百分之三，置 4 冰箱过夜。6.1.4 悬浮 浓缩过的样品液 3 5 0 0 -4 0 0 0 r/mi n离心 1 0 min去上清，沉淀物以少量 0.0 1 m o l/L p H7.4 P B S悬浮，成混悬液(肌肉样用 1 mL，骨髓样用 0.3 mL),6.1.5 去杂 在所得混悬液中加入 1/4体积的三氯甲烷，摇匀，3 5 0 0 -4 0 0 0 r/m i n离心取水相，置冰箱冻结保存备用。6.2 HA,HI 试验6.2.1 微量血凝试验(HA试
15、验)6.2.1.1 在 9 6 孔v型微量血凝反应板上，从第一孔至第十一孔，每孔加入。.0 1 mo l/L p H6.4 P B S-滴(0.0 2 5 m L)，然后在第一孔加入待检样品的浓缩液一滴，第十二孔加入阴性材料一滴，从第一 孔开始用移液器，作等量稀释至第十孔，最后一滴弃去。6.2.1.2 每 孔再加P B S 一滴，第十一孔是P B S 对照，第十二孔是阴 性材料(可用1:1 0 正常兔肝悬液对照)。6.2.1.3 每孔各加入 1%人“O 型红细胞一滴，立即在微型混合器上摇匀，置温室。待对照孔血细胞完全沉淀后观察结果。6.2.1.4 结果判定和血凝效价表示方法:.血 凝程度以#、
16、+、+、+、一 表示。#红细胞均匀铺于孔底，+十 基本同 上，但边境不整齐，有下垂趋向，+红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝结块，十红细胞于管底形成一个小团.但边缘不光滑，四周有凝结块，一红细胞于孔底形成小团，边缘整齐，光滑。结果以#为凝结终点。6.2.2 微量血凝抑制试验(HI 试验)6.2.2.1 在 9 6 孔 v型微量血凝反应板上，待检样品浓缩液稀释方法同上。一个样品作相同的二排6.2.2.2 第一排每孔加P B S一滴，第二排每孔n A 阳性血清一滴摇匀，3 7 0C温箱放置 1 0 m i n,6.2-2.3 各孔加入 1%人“O 型红细胞一滴，立即在微型混匀器上摇匀，置温室。待对照孔红细胞完全沉淀后观察结果。6.2-2.4 结果判定:血凝效价表示方法同6.2.1.4,血凝试验和血凝抑制试验两排孔的血凝效价相差二个滴度以上者则为阳性。6.3 I HA及I H I 试验(反相间接血凝试验和反相间接血抑试验)6.3.1 I HA试验6.3.1.1 反应在9 6 孔V型微量血凝反应板上进行。根据被检材料的份数，按每份材料一排孔安排，在反应板上依顺序编号。6.3.1.2 于计划各
