1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光犘 犆 犚方法犚 犪 狆 犻 犱犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犞 犻 犫 狉 犻 狅犘 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊犻 狀犳 狅 狅 犱 狊 犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犚 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲狇 狌 犪 狀 狋 犻 狋 犪 狋 犻 狏 犲犘 犆 犚犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准的附录 和附录均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出
2、并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中山大学达安基因股份有限公司。本标准主要起草人：翁文川、刘超、许龙岩、易敏英、胡科锋、焦红、王方金、程钢。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光犘 犆 犚方法范围本标准规定了进出口食品中副溶血性弧菌的实时荧光 快速检验方法。本标准适用于进出口食品中副溶血性弧菌的快速检验。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些
3、文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。食品卫生微生物学检验总则 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验 出口食品副溶血性弧菌检验方法 基因检验实验室技术要求缩略语下列缩略语适用于本标准。实时荧光定量犘 犆 犚实时荧光聚合酶链式反应。犆 狋值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。犇 犖 犃犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 犻 犮犪 犮 犻 犱简称脱氧核糖核酸。犱 犖 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 狅 狊 犻 犱 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧核苷三磷酸。犱 犃 犜 犘犱 犲 狅
4、狓 狔 犪 犱 犲 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧腺苷三磷酸。犱 犆 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犮 狔 狋 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧胞苷三磷酸。犱 犌 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犵 狌 犪 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 犺 狆 犪 狋 犲脱氧鸟苷三磷酸。犛 犖犜 犱 犜 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 狋 犺 狔 犿 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧胸苷三磷酸。犱 犝 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 狌 狉 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆
5、 犺 犪 狋 犲脱氧尿苷三磷酸。犘 犆 犚狆 狅 犾 狔 犿 犲 狉 犪 狊 犲 犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀聚合酶链式反应，简称 。犜 狉 犻 狊 狋 狉 犻 狊 犺 狔 犱 狉 狅 狓 狔 犿 犲 狋 犺 狔 犾 犪 犿 犻 狀 狅 犿 犲 狋 犺 犪 狀 犲三羟甲基氨基甲烷。犝 犖 犌狌 狉 犪 犮 犻 犾犖 犵 犾 狔 犮 狅 狊 狔 犾 犪 狊 犲尿嘧啶犖 糖基化酶。犜 犪 狇酶犜 犪 狇 聚合酶。犘 犅 犛磷酸盐缓冲生理盐水。测试方法 方法原理采用犜 犪 狇 方法，在比对副溶血性弧菌 基因的基础上，设计针对该基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针
6、 端标记了 荧光素为报告荧光基团（用 表示），端标记了 荧光素为淬灭荧光基团（用 表示），它在近距离内能吸收 端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上 基团发出的荧光信号被 基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，犜 犪 狇 聚合酶发挥其 外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的 基团游离出来，所发出的荧光不再为 所吸收而被检测所接收。随着 反应的循环进行，产物与荧光信号的增长呈现对应关系。培养基和试剂 氯化钠稀释液（见附录）。氯化钠蛋白胨液（见附录）。单料氯化钠多粘菌素肉汤（见附录）。灭菌双蒸水。离心管：、。吸管：、，分刻度
7、 。成套试剂盒配置 试剂盒引物：上游：下游：犛 犖犜 试剂盒探针：犜 犪 狇 探针：探针 端由 标记，端由 标记。提取试剂（已配成成品）。缓冲液：盐酸（），氯化钾，氯化镁。仪器和设备 全自动荧光定量 仪。普通 仪。微量荧光检测仪：上海棱光 （或同类型产品）。离心机：最大转速 以上。恒温培养箱：。天平：量程，感量。低温冰箱：。均质器。制冰机。恒温水浴箱：。灭菌样品处理器具：取样勺、剪刀、镊子。样品稀释瓶：、。可调移液器：、。操作步骤 样品的收集和处理 取样样品按 方法收样，无菌操作均匀取样。如为冷冻样品，应于解冻，且不超过；若不能及时检验，应置于 保存。非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及
8、时检验，应置于冰箱保存，在 内检验。无菌操作称取 检样放于均质杯内，以灭菌剪刀充分剪碎。增菌检测样品处理新鲜样品：上述均质杯内加入 氯化钠稀释液 ，均质混匀；取 样品稀释液接种到 单料氯化钠多粘菌素肉汤，进行选择性增菌培养。经加热、辐射处理或冷藏、冻结的样品：在均质杯内加入 氯化钠蛋白胨液 ，均质混匀；于 增菌培养。无需增菌直接检测样品处理在均质杯内加入 氯化钠稀释液 ，混合均匀后，直接进行模板 的提取。模板犇 犖 犃的提取从样品增菌液的表层（或样品稀释液管中）取 培养液加入到 无菌离心管中，离心 ，尽量弃去上清液，加入 灭菌的双蒸水清洗次后离心，同样尽量弃去上清液。加入 提取液充分混匀，室温
9、放置 后，进行沸水浴 ，离心 ，将上清液转移至新管备用（提取的 应在内进行 扩增或放置于 冰箱）。荧光定量犘 犆 犚检验 检验准备从试剂盒中取出 反应管，加入提取好的 模板。每次检验分别设置含有扩增片断的质粒为阳性对照，灭菌双蒸水为阴性对照，以及临界阳性对照。犛 犖犜 全自动荧光定量犘 犆 犚仪测试全自动荧光定量 仪扩增反应参数设置：第一阶段，预变性，；第二阶段，个循环；第三阶段，个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。荧光通道选择。普通犘 犆 犚仪合并微量荧光检测器测试第一步：仪扩增反应条件设为预变性 ；变性；退火及延伸，个循环；暂停，保温，迅速逐个将反应管放入荧光检测仪，读
10、取并记录读数犃（初始荧光值）。第二步：仪扩增反应条件设为预变性 ；变性；退火及延伸，个循环；暂停，保温，同样迅速逐个将扩增后的反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数犃（终止荧光值）。荧光检测器设定：荧光激发波长为 ，检测波长为 。结果及判断 全自动荧光定量犘 犆 犚仪结果判断 阈值设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。质控标准阴性质控品：扩增曲线不呈型曲线或者 值 。阳性质控品：扩增曲线呈 型曲线，强阳性质控品定量参考值在 基因拷贝 基因拷贝 范围；临界阳性质控品定量参考值在 基因拷贝 基因拷贝 范围。以上要求需在同一次实验
11、中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。结果描述及判定 阴性扩增曲线不呈型曲线或 值等于，表示样品中无副溶血性弧菌，或者样品中副溶血性弧菌低于检测低限。阳性扩增曲线呈型曲线且 值小于等于，表示样品中存在副溶血性弧菌。实验灰度区若 值，实验需要重新进行。若重做结果的 值小于，且扩增曲线呈型曲线，则判为阳性；否则增菌后复检。普通犘 犆 犚仪和荧光检测器结果判断计算每个样品荧光检测器两步结果的差：犃狓犃犃。将阴性质控品管的犃狓称为犖，临界阳性标准品的犃狓值称为犘，强阳性标准品的犃狓称为犘。如：阴性质控品为阴性；阳性标准品为阳性；同时犘、犘、犖应满足犘犘犖时，本次实验有效；否则，实验无效，应检查试
12、剂、仪器、反应条件等方面的误差。实验有效的前提下，样品犃狓犖（犘犖）判为阳性；如果犖（犘犖）犃狓犖（犘犖）则属于实验灰度区，需重复实验一次，若重复实验结果犃狓值犖（犘犖）判为阳性，否则判为阴性；如果犃狓值犖（犘犖）判为阴性。犛 犖犜 确证检验筛选出阳性的样本，按 和 进行确证。计数副溶性弧菌的计数按 进行。方法灵敏度经 培养增菌，样品的检测限为 ；若不经过增菌，样品的检测限是 。检验程序见附录。防止污染和废弃物处理的措施 检验过程中防止交叉污染的措施按照 的规定执行。检验过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）培养基和试剂犃 犵犔氯化钠稀释液氯化钠 蒸馏水 加热
13、溶解，调至 ，高压灭菌 ，以无菌操作分装于 广口瓶或 三角瓶，每瓶 。犃 犵犔氯化钠蛋白胨水（犘犠）蛋白胨 氯化钠 蒸馏水 将各成分加热溶解，调至 ，无菌操作分装于 广口瓶或 三角瓶，每瓶 。犃 氯化钠多粘菌素犅肉汤（犛 犘 犅）酵母浸膏 蛋白胨 氯化钠 多粘菌素 单位 培养基蒸馏水 将各成分（除多粘菌素 外）加热溶解，校正 ，于 高压灭菌 ，待冷至 时加入多粘菌素（配成水溶液）混匀，分装于灭菌的 试管，每管 。犃 试剂盒组成试剂盒组成见表 。表 犃 试剂盒组成组分名称规格数量 提取液 管 反应管（或用于 的反应盖）人份管 临界阳性质控品 管强阳性质控品 管阳性定量参考品（基因拷贝）管阳性定量参考品（基因拷贝）管阳性定量参考品（基因拷贝）管阳性定量参考品（基因拷贝）管阴性质控品 管犛 犖犜 说明：犇 犖 犃提取液的主要成分为异硫氰酸胍和氢氧化钠，于保存。犘 犆 犚反应管中含有特异性引物、探针及各种离子。使用时的注意事项：由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。除 提取液外，其他试剂 保存。有效期为个月。犛 犖犜 书书书犛 犖犜 附录犅（规范性附录）荧光犘 犆 犚检验方法程序图犅 荧光犘 犆 犚检验方法程序犜犖犛书号：定价：元
