1、ICS13.060Z 16DB37山东省地方标准DB37/T 37872019水质粪大肠菌群测定光度法Water qualitydetermination of fecal coliformsphotometric method2019 - 12 - 24发布2020 - 01 - 24实施山东省市场监督管理局发布DB37/T 37872019目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14分光光度法15荧光法4前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省生态环境厅提出并组织实施。本标准由山东省环保标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省生态环境监测中心、青岛
2、佳明测控科技股份有限公司、北京华夏科创仪器 股份有限公司。本标准主要起草人：李恒庆、由希华、宗雪梅、王婷、王聪、郑琳琳、邹康、潘光、周成、张芳、张爱芳。6水质粪大肠菌群测定光度法1 范围本标准规定了测定水中粪大肠菌群的分光光度法和荧光法。本标准适用于地表水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的应急现场快速测定。本方法的检出限为30 MPN/L，检测范围：30109 MPN/L，检测周期不大于18 h。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 14581水质
3、湖泊和水库采样技术指导HJ/T 91地表水和污水监测技术规范HJ 494水质采样技术指导3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1粪大肠菌群fecal coliforms44.5 培养能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。3.2最大可能数most probable number，MPN最大可能数（most probable number，缩写为MPN），又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。4 分光光度法
4、4.1 方法原理一定量的水样与选择性培养基混合均匀放置于44.5 环境下，粪大肠菌群产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase），并分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，通过连续分光光度（波长：300 nm600 nm）测定，依据待测水样色度变化与水中粪大肠菌群数成一定关系的原理，得出粪大肠菌群浓度。4.2 干扰和消除4.2.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（4.5.1）时加入硫代硫酸钠溶液（4.3.4）消除干扰。4.2.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（4.5.1）时加入乙二胺四乙酸
5、二钠溶液（4.3.5）消除干扰。4.3 试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。4.3.1 粪大肠菌群检测试剂主要成分： 蛋白胨：5 g； 硫酸锰：0.005 g； 硫酸镁：0.001 g； 硫酸锌：0.001 g； 磷酸盐：1.78 g； 两性霉素B：0.60 g； 蒸馏水1 000 mL。制法：上述试剂溶于蒸馏水中，充分混匀，调整pH值为7.27.4，68.95 kPa(115 )，高压灭菌20 min，分装贮存于4 避光备用。注： 也可采用市售商品化培养基制品。4.3.2 硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）。4.3.3 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2
6、2H2O）。4.3.4 硫代硫酸钠溶液：（Na2S2O3）=0.10 g/mL，称取15.7 g硫代硫酸钠（4.3.2），溶于适量水中，定容至100 mL，临用现配。4.3.5 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：（C10H14N2O8Na22H2O）=0.15 g/mL，称取15 g乙二胺四乙酸二钠（4.3.3），溶于适量水中，定容至100 mL，此溶液保质期为30 d。4.3.6 无菌水：取适量纯水，经121 高压蒸汽灭菌20 min，备用。4.4 仪器和设备4.4.1 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的100 mL、250 mL、500 mL广口玻璃瓶。注： 在采集不存在或不考虑余氧、金属
7、离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。4.4.2 微生物快速检测仪： 恒温培养单元：不少于2个温控系统，温度控制精度1 ，可自动调节待检测样本培养温度（44.5 1 ）； 检测单元：不少于4个独立的检测系统，可实现多个样本的同时监测； 数据显示、处理单元：自动输出检测结果，可查询和显示历史数据。4.4.3 高压蒸汽灭菌器：121 可调、101.3 kpa。4.4.4 量筒：50 mL、100 mL。4.4.5 移液管：1 mL、10 mL。4.4.6 天平：感量0.01 g。注： 移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具试验前应按无菌操作要求包扎，121 高压蒸汽灭菌20 min，烘干
8、，备用。4.5 样品4.5.1 样品采集点位布设及采样频次按照GB/T 14581、HJ 494和HJ/T 91的相关规定执行。与其它项目一同采样时，先单独采集微生物样品，采样瓶（4.4.1）不得用水样洗涤，采集水样于灭菌的采样瓶中。采集河流、湖库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水面10 cm15 cm处，瓶口朝水流方向，拔玻璃塞，使水样灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的80%左右。采好水样后，迅速扎上无菌包装纸。采集地表水、废水样品及一定深度的水样时，可使用灭菌过后专用采样装置采样。在同一采样点进行
9、分层采样时，应自上而下进行，避免不同层次的搅扰。如果采集的是含有活性氯的样品时，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（4.3.4），以除去活性氯对细菌的抑制作用(每125 mL容积加入0.1 mL的硫代硫酸钠溶液)；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（4.3.5），以消除干扰（每125 mL容积加入0.3 mL的乙二胺四乙酸二钠溶液）。注： 15.7 mg硫代硫酸钠(4.3.2)可去除样品中1.5 mg活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。4.5.2 样品保存采样后应在2 h内检测，否则，应10 以下冷藏但不得超过6 h
10、。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于4 以下冷藏并在2 h内检测。4.6 分析步聚4.6.1 接种接种待测水样于装有5 mL培养基的检测瓶中，定容至20 mL，水样与培养基应充分混匀。4.6.2 培养打开仪器电源开关，待仪器稳定30 min后，将接种后的检测瓶放置于微生物快速检测仪中，按照仪器说明书进行操作，设置检测温度为44.5 ，点击“检测”按钮，218小时，仪器自动培养得出结果。4.6.3 对照试验4.6.3.1 空白对照采用无菌水（4.3.6）作为待测水样按照本标准4.6.14.6.2进行空白测定，测试结果不得检出，否则该次样品测定结果无效，应重新测定空白以及待测样品。4.6.
11、3.2 阴性及阳性对照粪大肠菌群的阴性、阳性菌株参考表1。表1 阴性、阳性菌株参照表检测指标阳性菌种阴性菌种粪大肠菌群大肠埃希氏菌（耐热型）、克雷伯氏菌属(Klebsiella trevisan)（耐热型）产气肠杆菌、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、假单胞菌属将标准菌株制成3003 000个/mL的菌悬液，将菌悬液按接种（4.6.1）和培养（4.6.2）要求操作，阳性菌株应呈现阳性反应；阴性菌株呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应重新测定。注： 可先制备较高浓度菌悬液，采用血球计数器在显微镜下对其浓度进行初步测定，再根据实际情况用无菌水(4.3.6)稀释至30
12、0 MPN/mL3 000 MPN/mL。4.7 结果计算与表示微生物快速检测仪自动计算检测结果，结果以科学计数方法表示。4.8 精密度和准确度微生物检测数据为偏态分布，按其统计分析要求，其检测所得结果全部经对数（以10为底）转换后进行以下分析。4.8.1 精密度6家实验室对粪大肠菌群有证标准样品（7 620 MPN/L）进行测定：实验室内相对标准偏差为1.92 %4.77 %，实验室间相对标准偏差为3.98 %，重复性限为0.32，再现性限为0.52。6家实验室对3个不同浓度实际样品（浓度为107 MPN/L、105 MPN/L、103 MPN/L）进行测定：实验室内的相对标准偏差范围分别为
13、：0.64 %2.36 %、1.07 %3.06 %、2.42 %6.81 %，实验室间的相对标准偏差分别为：0.91 %、0.89 %、2.64 %，重复性限为0.34、0.35、0.49，再现性限为0.36、0.35、0.52。4.8.2 准确度6家实验室分别对有证标准菌株（所使用的标准菌株浓度为7 620 MPN/L）进行测定，相对误差为：-8.24 %1.43 %，相对误差的最终值为：-3.56 %7.82 %。4.9 质量保证和质量控制4.9.1 每批样品按对照试验（4.6.3）进行空白对照测定，定期使用有证标准菌株进行阳性、阴性对照试验。4.9.2 每批次实验取待测水样数量的10
14、%，做双样分析，检测结果以双样平均值计。4.9.3 对每批次培养基应使用有证标准菌株进行培养基质量检验。4.9.4 按有证标准菌株保存条件的要求，严格控制质量。4.10 废弃物的处理实验产生的废弃物经121 高压蒸汽灭菌20 min后，作为一般废物处理。5 荧光法5.1 方法原理一定量的水样与选择性培养基混合均匀放置于44.5 环境下，粪大肠菌群产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase），并分解-半乳糖苷释放出荧光。疏水的荧光产物聚合至光学检测区，通过光度计（波长：350 nm650 nm）测定，依据荧光强度与水中粪大肠菌群数成一定关系的原理，从而得出粪大肠菌群浓度。5.2 干扰和消
15、除按本标准4.2条进行。5.3 试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。5.3.1 粪大肠菌群检测试剂主要成分： 聚合氨基酸1.3 g； 氯化钠0.34 g； 磷酸盐0.36 g。制法：聚合氨基酸、氯化钠和磷酸盐，3种固体粉末至于容器中充分混匀，115 高压灭菌20 min，贮存于4 避光备用。注： 也可采用市售商品化培养基制品。5.3.2 硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）。5.3.3 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na22H2O）。5.3.4 硫代硫酸钠溶液：同4.3.4。5.3.5 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：同4.3.5。5.3.6 无菌水：同4.3.6。
