1、 ICS 11.220 CCS B 41 34 安徽省地方标准 DB34/T 42032022 猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定规程 Regulation for detection of extraintestinal pathogenic Escherichia coli from swine 2022-06-29 发布 2022-07-29 实施 安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 42032022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文
2、件由安徽农业大学提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽农业大学，安徽浩翔农牧有限公司，马鞍山史记动物健康管理有限公司，安徽省动物疫病预防与控制中心，阜阳市动物卫生监督所，合肥市动物疫病预防控制中心，阜阳市颍东区枣庄镇农业综合服务站，巢湖市畜牧兽医局，六安市动物疫病预防与控制中心，滁州市凤阳县府城畜牧兽医站，安徽省猪业协会。本文件主要起草人：李郁，李亮，谢玉洁，黄晓慧，李超，邢刚，刘雪兰，段倩倩，李春芬，程圣芳，孙裴，何长生，高亚飞，陈田梅。DB34/T 42032022 1 猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定规程 1 范围 本文件规定了猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定所需的主要设备和材
3、料、操作规程、结果报告和废弃物无害化处理与人员安全防护。本文件适用于猪肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验 GB 4789.38 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数 GB 4789.41 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 2025 动物检
4、疫实验室生物安全操作规范 SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。肠外致病性大肠杆菌 extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC 是一组不同种类的不仅可正常定殖于畜禽等肠道，而且能侵入血液循环系统引起菌血症，并诱发败血症或局部肠道外感染的大肠杆菌。4 主要设备和材料 显微镜：10100。电子天平：感量 0.1 g。恒温培养箱：37。冰箱：04。无菌培养皿：直径 75 mm 或 90 mm。无菌试管：12 mm100 mm，15 mm150 mm。麦氏比浊管。pH 计、
5、pH 比色管或精密 pH 试纸。饱和氯化钠溶液：见附录 A 中 A.1。30甘油缓冲盐水溶液：见附录 A 中 A.2。DB34/T 42032022 2 麦康凯培养基（MAC）：按照 GB 4789.6 规定执行。革兰氏染色液：按照 GB 4789.41 规定执行。三糖铁（TSI）琼脂斜面培养基：按照 GB 4789.6 规定执行。蛋白胨水和靛基质试剂：按照 GB 4789.6 规定执行。缓冲葡萄糖蛋白胨水和甲基红试剂、V-P 试剂：按照 GB 4789.38 规定执行。枸橼酸盐培养基：按照 GB 4789.38 规定执行。LB 固体培养基：见附录 A 中 A.3。试验小鼠：68 周龄，体重
6、18 g22 g，清洁级。大肠杆菌 O 抗原单因子标准血清。5 操作规程 操作流程 ExPEC分离鉴定的流程示意图见附录B。操作步骤 5.2.1 样品采集 5.2.1.1 采集：无菌操作采集病猪的肝脏、肺脏、脾脏、淋巴结、脑等肠外组织，或关节积液、心包积液。5.2.1.2 保存与运输：病料样品采集后不能及时送检的，可保存于饱和氯化钠溶液或 30 甘油缓冲盐水溶液中，保存时间不超过 72 h。样品均需采取低温（04）保存和运输。5.2.2 细菌分离与纯化 无菌操作将病料样品接种于麦康凯培养基（MAC），37培养 18 h24 h，挑取疑似单个菌落（菌落呈鲜桃红色或粉红色，中等大小，直径 1.0
7、mm2.5 mm，圆形，边缘整齐，表面光滑）再次划线接种于MAC，37 培养 18 h24 h（即纯化）后进行大肠杆菌鉴定。5.2.3 肠外大肠杆菌鉴定 5.2.3.1 形态特征鉴定：革兰氏染色镜检。大肠杆菌为革兰氏阴性直短杆菌，两端钝圆，无芽孢，多散在，也有成对排列。5.2.3.2 生化特性鉴定：先取纯化菌落接种三糖铁（TSI）琼脂斜面培养基，37 培养 18 h24 h。大肠杆菌为斜面和底面均变黄或变红，产气，不产 H2S。之后将纯化菌落分别接种蛋白胨水、缓冲葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐培养基，37 培养 18 h24 h，进行吲哚试验（I）、甲基红试验（MR）、V-P 试验（Vi）、枸橼酸盐
8、利用试验（C），简称 IMViC 试验。大肠杆菌为 IMViC 。按照 GB 4789.38、GB 4789.6 执行。5.2.4 肠外大肠杆菌致病性鉴定 取10只健康状态良好小鼠，分成试验组和对照组，每组 5 只。将5.2.3中两条鉴定均符合的大肠杆菌分离株制成浓度约为 0.5 麦氏比浊度的菌悬液，分别腹腔注射试验组小鼠，每只 0.3 mL。对照组小鼠每只腹腔注射 0.3 mL 用于稀释菌液的无菌生理盐水。注射后观察 3 d 内小鼠精神状况及死亡情况。若对照组小鼠均健活，试验组小鼠出现精神萎靡，不进食，静止抱团不活动，最后死亡的临床症状，并将死亡的小鼠在无菌操作下取其肺脏、肝脏、脾脏组织分别
9、接种于MAC，37 培养 24 h，挑取大肠DB34/T 42032022 3 杆菌疑似菌落进行革兰氏染色镜检，将符合大肠杆菌形态特征的细菌纯化后接种TSI，并进行IMViC试验，结果与接种菌株一致则说明待检大肠杆菌分离株为ExPEC。5.2.5 肠外致病性大肠杆菌 O 抗原血清型鉴定 见附录C。5.2.6 肠外致病性大肠杆菌系统进化群鉴定 见附录D。6 结果报告 符合 5.2.2，5.2.3，5.2.4，可确定为 ExPEC。符合 6.1，且根据 5.2.5，可确定为某种 O 抗原血清型的 ExPCE。符合 6.1，且根据 5.2.6，可确定为某种系统进化群的 ExPCE。7 废弃物无害化处
10、理与人员安全防护 应按照 GB 19489、SN/T 2984 和 SN/T 2025 的规定执行。DB34/T 42032022 4 附录A （资料性）培养基的配制 A.1 饱和氯化钠溶液 A.1.1 成分 氯化钠 38.0 g39.0 g 蒸馏水 100 mL A.1.2 制法 将 38.0 g39.0 g 氯化钠加入 100 mL 蒸馏水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，分装于采样管，每管 5 mL10 mL，121 高压灭菌 15 min 备用。A.2 30甘油缓冲盐水溶液 A.2.1 成分 氯化钠 0.5 g 碱性磷酸钠 1.0 g 中性甘油 30 mL 蒸馏水 100 mL A.2.
11、2 制法 先将盐类成分溶于水中，然后加入甘油，混匀，分装于采样管，每管5 mL10 mL，121高压灭菌15 min 备用。A.3 LB 固体培养基 A.3.1 成分 胰蛋白胨 10.0 g 酵母提取物 5.0 g 氯化钠 10.0 g 琼脂 15.0 g20.0 g 蒸馏水 1000 mL A.3.2 制法 将 A.3.1 中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至 7.4 0.2，121灭菌 20 min，待冷却至50 左右时倾注平板。DB34/T 42032022 5 附录B （资料性）猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定流程 见图B.1。图B.1 猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定流程检 样 麦康凯
12、培养基分离培养（菌落呈鲜红色或粉红色，中等大小，直径 1.0 mm2.5 mm，圆形，边缘整齐，表面光滑）选取可疑菌落涂片镜检、纯培养（革兰氏阴性直短杆菌，两端钝圆，无芽孢，多散在，也有成对排列）生化试验（TSI：斜面和底面均变黄或变红，产气，不产 H2S。IMViC+-）肠外大肠杆菌 动物试验 肠外致病性大肠杆菌 结果报告 O 抗原血清型 PCR 鉴定 系统进化群 PCR 鉴定 DB34/T 42032022 6 附录C （资料性）猪肠外致病性大肠杆菌 O 抗原血清型鉴定 C.1 ExPEC 的 O 抗原制备 将ExPEC接种于LB固体培养基上，37 培养 18 h24 h，用 3mL 0.
13、5 石炭酸生理盐水将菌苔洗下，置于试管中，制成浓稠的悬液，121 高压灭菌 2 h，破坏其K抗原，即为O抗原，储存于 4 备用。C.2 ExPEC 的 O 抗原玻片凝集试验 取O抗原分别与大肠杆菌的O抗原单因子血清进行玻片凝集反应。即O抗原和O抗原单因子血清各取15 L 在玻片上混匀，2 min 内出现明显凝集者为阳性反应。同时以O抗原与 0.5 石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝集现象。玻片凝集试验判定标准见表C.1。表C.1 玻片凝集试验判定标准 反应强度 判断依据 对应结果+液体完全透明，出现大的凝集块 阳性+液体几乎完全透明，有明显凝集块 阳性+液体不甚透明，有可见凝集块 阳性+
14、液体浑浊，有小的颗粒状物 阴性-液体浑浊，无凝集现象 阴性 C.3 ExPEC 的 O 抗原的试管凝集试验 经过玻板凝集试验初步筛选可能的O血清型，然后通过试管凝集试验确定其O血清型。定型标准为血清的试管凝集价 1:640。其步骤如下：a)O 抗原单因子定型血清的稀释：采取倍比稀释法。取洁净试管 8 支并标记，每支试管用移液器加入 0.5mL 0.5 石炭酸生理盐水。用移液器吸取 1:10 稀释的大肠杆菌抗 O 因子血清0.5 mL 加入第 1 管，在管内反复吹打 68 次，使血清与生理盐水充分混合，然后吸取 0.5 mL 加入第 2 管，同样混合均匀后吸取 0.5 mL 加入第 3 管，重复
15、上次操作，直至第 7 管，混匀后从第 7 管中吸取 0.5 mL 弃去。第 8 管不加血清作为对照。此时从第 1 管到第 7 管的血清稀释倍数分别是 1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280；b)加入抗原：向各支试管中分别加入 0.5 mL O 抗原，此时血清稀释倍数相应增大一倍；c)抗原抗体反应：将各管混合液震荡摇匀，置于 37 水浴锅 4 h 或在室温中过夜，观察结果；d)结果判定如下：1)生理盐水对照管中的抗原应分散，无凝集块沉淀，并呈混浊悬液；2)试验管如有凝集，管底可见到凝集块，液体上部澄清、半澄清或混浊度降低，管底凝集块轻摇即浮起，呈片块状；3
16、)凝集强弱判断（以“”表示）：确定抗体凝集效价时，应以出现“”（50）凝集现象的最高血清稀释度为抗血清的凝集价；“”液体完全透明，100凝集，管底出现大片的伞状沉淀，震荡时呈大片絮状，但可打碎成小絮片状；“”液体几乎透明，75凝集，管底有明显的伞状沉淀，震荡时呈小或大絮片状；DB34/T 42032022 7 “”液体中等混浊，50凝集，管底有中等量的伞状沉淀，震荡时呈小絮片状；“”液体透明度不明显，25凝集，管底有少许不明显的伞状沉淀；“”抗原抗体不凝集，液体混浊、无透明度，管底无伞状沉淀，但由于菌体自然下沉，管底中央出现圆点状沉淀，震荡时呈均匀混浊状态。DB34/T 42032022 8 附录D （资料性）猪肠外致病性大肠杆菌系统进化群 PCR 鉴定 D.1 材料准备 D.1.1 主要仪器 PCR扩增仪、1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR反应管、水浴锅、高速冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、移液器吸管。D.1.2 主要试剂 2 PCR Master Mix、超纯水、琼脂糖、10mg/ML溴化乙锭（EB）、TBE 缓冲液、上样缓冲液（10 Loading Buffer
