1、ICS 11.22 B 41 备案号：DB42 湖北省地方标准 DB 42/T 11092015 牛流行热诊断和防治技术规范 Technique guideline on diagnosis,treatment and prevention of bovine ephemeral fever （报批稿）2015-10-30 发布 2015-12-20 实施 湖北省质量技术监督局 发 布 DB42/T 11092015 I 目 次 前言.II 引言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 诊断.1 3.1 诊断指标.1 3.2 结果判定.2 4 综合防治.2 4.1 免疫.2 4.2
2、治疗.3 4.3 疫情处置.3 4.4 生物安全措施.3 附录 A（规范性附录）牛流行热病毒 RT-PCR 检测方法.4 DB42/T 11092015 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由华中农业大学提出。本标准由华中农业大学归口管理。本标准起草单位：华中农业大学。本标准协作起草单位：随州市弘大畜牧有限责任公司、湖北省松滋市春珍肉牛养殖场。本标准起草人：郭爱珍、晁金、邓明亮、彭清洁、胡长敏、陈颖钰、曹永强、周春、陈焕春。DB42/T 11092015 III 引 言 牛流行热（
3、Bovine ephemeral fever,BEF），又称牛暂时热、三日热，是由牛流行热病毒引起的一种急性、热性、蚊媒传播性传染病，其特征为：发病突然，迅速波及全群，病牛高热，呼吸急促，流透明或带泡沫状涎水，流泪，运动障碍，妊娠牛可发生流产。该病在炎热、多雨、蚊蠓滋生季节流行，是危害湖北省养牛业的重要疫病。由于发病急、传播快，治疗难度大。为有效预防和控制牛流行热，特制定本技术规范，供湖北省养殖企业和养殖户参照使用。DB42/T 11092015 1 牛流行热诊断和防治技术规范 1 范围 本规范规定了牛流行热疫情的诊断和综合防治技术。本规范适用于湖北省牛养殖企业和养殖户对牛流行热的诊断和防治。
4、2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是标注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 3 诊断 3.1 诊断指标 3.1.1 流行病学调查 对发病场进行流行病学调查，根据发病地区、发病对象、发病季节、传播方式、主要症状等，进行初步诊断。该病流行病学特点主要如下：a)主要侵害牛，黄牛、奶牛、水牛均可感染发病，奶牛、黄牛易感性最大，水牛易感性较低；b)以 3 岁5 岁壮年牛发病最多，犊牛和老龄牛发病少；c)传染源主要为临床发病牛，发热期病牛血液、呼
5、吸道分泌物及粪便中都带有病毒；d)蚊、蝇、蠓等吸血昆虫经叮咬传播该病；e)呈明显季节性，多发于雨量多和气候炎热的 6 月9 月；f)传播迅速。3.1.2 临床观察 对发病牛进行临床症状观察，获得进一步的诊断依据。该病的临床症状特点主要如下：a)潜伏期为 3 天7 天，发病突然，迅速传播至全群；b)体温升高到 40以上，稽留 2 天3 天，之后恢复正常；c)显著流涎，口角有泡沫；d)鼻镜干而热，流鼻液；e)流泪，有水样眼屎，眼睑肿胀，结膜充血；f)呼吸促迫，呼吸次数可达 80 次/分以上，甚至因窒息死亡；g)病牛呆立，步态僵硬(故名“僵直病”)，跛行，严重者后肢麻痹、站立困难、瘫痪；h)食欲废绝
6、，反刍停止；i)妊娠母牛可发生流产、死胎；j)泌乳量下降或泌乳停止。DB42/T 11092015 2 3.1.3 病理剖检 对病死牛进行病理剖检，重点观察呼吸系统病变，对临床初步诊断进行验证。主要病理变化如下：a）肺气肿明显，有时伴有肺水肿和充血，气管积有多量泡沫状黏液；b）真胃、小肠和盲肠可见黏液增多、出血、黏膜脱落等变化；c）肝、脾、肾轻度肿胀，有局灶性坏死病变。3.1.4 病原学诊断 病原学诊断是确诊该病的关键依据，主要有核酸检测和病毒分离鉴定。3.1.4.1 临床样本的 RT-PCR 检测 a)模板提取：取病牛发热期肝素钠抗凝血，反复冻融3次，用病毒RNA提取试剂盒提取RNA。b)R
7、T-PCR：针对牛流行热病毒G基因计设引物，进行RT-PCR扩增，扩增产物送商业公司测序和分析。操作方法见附录A。3.1.4.2 病毒分离鉴定 a)细胞培养：取病牛发热期肝素钠抗凝血5 mL10 mL,反复冻融3次后，4离心（1000 g）5 min后取上清，接种于在DMEM培养基中（含10%胎牛血清）长成单层的乳仓鼠肾细胞或非细胞或绿猴肾细胞，让上清液铺满细胞单层，37吸附1h（其间轻轻振荡数次），加入含2%胎牛血清的DMEM细胞维持液中，置37培养2天3天，连续观察是否出现细胞病变。若出现病变，则待细胞出现80%细胞病变时终止培养，将培养物冻融3次后，经无菌检验合格后，小管分装（1 mL/
8、管），-70冻存备用，进行RT-PCR检测确诊；若未发生细胞病变，盲传3代，至出现细胞病变；若盲传3代后仍未出现细胞病变,且用3.1.4.1方法（RT-PCR）鉴定为阴性者，视为阴性；若盲传3代后仍未出现细胞病变但RT-PCR鉴定为阳性者视为阳性，继续传代，直至出现细胞病变。b)动物接种试验：取病牛发热初期肝素钠抗凝血液5 mL10 mL，分离白细胞，取30 L对出生1日龄内乳鼠或乳仓鼠脑内接种（接种1代），每日观察2次，一般5天6天发病，不久死亡。取死鼠脑制备乳剂（用生理盐水冲洗3-4次脑组织，然后研磨，用4层纱布对研磨液进行过滤，滤液即为乳剂），按以上方法接种乳鼠（接种2代），连续3次传代
9、后，可100%致死接种乳鼠，然后取脑组织乳剂进行3.1.4.1描述的RT-PCR检测，进行确诊。3.2 结果判定 对上述检测结果进行如下判断：a)疑似牛流行热病例：符合该病的流行病学调查（参见3.1.1）和临床观察（参见3.1.2）或病理剖检（参见3.1.3）之一，即可定为疑似牛流行热病例。b)确诊牛流行热病例：疑似牛流行热病例，病原学诊断（参见3.1.4.1和3.1.4.2）任何一项阳性，均可确诊为牛流行热。4 综合防治 4.1 免疫 每年在蚊蝇蠓滋生季节到来前1.5月2月，给牛接种牛流行热疫苗，间隔3周再以同样剂量加强免疫1次，接种途径和剂量参照产品说明书。免疫保护期6个月。DB42/T
10、11092015 3 4.2 治疗 主要进行对症治疗，包括退热、缓解呼吸困难、强心、消炎镇痛、抗菌措施。4.3 疫情处置 任何人如发现疑似疫情，应及时向企业主管领导和当地兽医部门报告，并采取隔离、消毒等生物安全措施防止疫情扩散。同时，采样送相关实验室进行病原学检测确诊。4.4 生物安全措施 4.4.1 消毒 a)杀灭传播媒介：取2.5%溴氰菊酯（敌王）乳剂，按产品使用说明书稀释，喷洒牛舍、运动场和排粪沟等环境设施，每周两次，杀灭蚊、蝇、蠓等节肢动物。b)环境设施消毒：用商业化消毒剂（二氧化氯、过氧乙酸、甲醛等），按产品使用说明书规定浓度，对牛舍地面、食槽、车辆、对发病或病死动物的排泄物和污染物
11、进行消毒，以杀灭病毒，减少传染源。c)人员出入消毒：对于进、出场的人员，进行消毒。d)车辆、工具出入消毒：用商业化消毒剂（二氧化氯、过氧乙酸、甲醛等），对出入车辆、工具进行消毒。4.4.2 无害化处理 病死牛、污染的垫料和饲草等，按GB 16548进行无害化处理。4.4.3 产品处理 a)发病动物禁止急宰销售。b)治疗期间的牛奶和牛肉等牛产品，禁止上市销售。c)对于治疗痊愈牛生产的牛奶和牛肉等牛产品，其上市须符合国家对有关药物的休药期规定。DB42/T 11092015 4 A A 附 录 A（规范性附录）牛流行热病毒 RT-PCR 检测方法 A.1 引物设计与合成 根据牛流行热病毒（Bovi
12、ne ephemeral fever，BEFV）主要免疫保护性糖蛋白 G（BEFV-G）的保守核苷酸序列（GenBank登录号AF058321）设计引物，序列为：BEFV F（5ATTTACAATGTTCCGGTGAA3）（nt 1938）BEFV R（5GGTATCCATGTTCCGGTTAT3）（nt 523542）引物由商业公司合成。扩增片段大小为523bp。A.2 方法 A.2.1 RNA的提取与反转录合成cDNA 采集高热期病牛全血5 mL10 mL，肝素钠抗凝。采用病毒RNA提取试剂盒（TIANGEN）提取血液的总RNA。用反转录试剂盒（Takara,Japan）进行反转录（rev
13、erse transcription,RT）成cDNA。体系为：5gDNA Eraser buffer 2 L，gDNA Eraser 2 L，RNA 7 L；室温放置5min；然后加primeScript RT Enzyme mix 1 L，RT primer mix 1 L，5primeScript buffer 21 L，Rnase free H2O 4 L，总体积20 L，混合均匀。反应条件：37 15 min，85 5 s，4 5 min。A.2.2 PCR PCR反应体系为：cDNA 2 L，LA taq 聚合酶0.25L，10LA buffer 2.5 L，dNTP mixture 2 L，上下游引物（F、R）各0.5 l，加至H2O 25 L。PCR 反应条件为：95 预变性4min；95 变性1 min，50 退火45 s，72延伸53 s，35个循环；72 延伸10 min，16 20 min。PCR产物4保存。A.3 结果判断 将RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，预期产物大小为523bp，在凝集染色后出现特异性目的条带。序列测定后，将获得的产物序列与GenBank（GenBank登录号AF058321）发表序列比对，相似性在99%以上时，确定为牛流行热病毒。_
