1、细胞凋亡（APOPTOSIS）一一 .细胞凋亡的研究历史细胞凋亡的研究历史 1 1.凋亡概念的形成和形态学的研究凋亡概念的形成和形态学的研究(1972）1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。Kerr 等在研究肝缺血时注意到两种不同的细胞死亡形式。第一种,细胞膜解体、细胞器形态改变、溶酶体消失即坏死,而第二种则细胞膜完整、细胞器形态完整、染色质固缩、核碎裂。细胞最终自行分割为若干外膜完整的小体。Kerr根据这些表现套用希腊语描写树叶凋落的名词apoptosis(凋亡)(apo:away,from 离开;ptosi
2、s:falling 落下)来命名这种细胞死亡形式。2 2DNADNA的降解和内源性核酸内切酶的参与的降解和内源性核酸内切酶的参与。(1987）3 3.蛋白质水解酶活化的研究蛋白质水解酶活化的研究(1995)4 4.细胞膜的变化细胞膜的变化(1997)5 5.线粒体的变化和分子生物学的研究线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-)1)相关基因及调控 2）信号转导 3）各种分子及其相互作用及相互关系 4）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。在发育过程中及成熟细胞中，部分细胞死亡是正常过程，(Glicksmann,1950)。这种正常的细胞死亡是动物细胞的基本特性，它发生在大部分发育中的组织，
3、许多组织整个生命过程中都存在正常的细胞死亡。1964年 Lockshin 和 Williams等在研究昆虫变态时便注意到一些细胞按明显的规律的预定程序死亡,从而提出程序性死亡(programmed cell death)这一概念。二.概念 细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀，由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程。细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）PCD最初是1956年发育生物学中提出的概念，是个功能性概念，强调的是其分子生物学和生理功能，一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的
4、正常组成部分。近年来认为程序死亡是指发生在部分正常生理性稳定的内环境，特别是在胚胎发生中的死亡，这对正常细胞更新及在发育过程中重整模式是必要的。因此，程序性细胞死亡代表的不是细胞对外来损伤的效应，而是对激素、生长因子及离子内环境稳定改变的反应。Kerr等根据绝大部分哺乳类动物细胞的程序性死亡过程中其超微结构改变与凋亡相似,认为所有程序性死亡都是通过凋亡实现的。他们这一假设后来被广泛接受。另外一些学者认为程序性细胞死亡是一种由细胞特定基因调控的细胞自杀过程,是功能性概念,而细胞凋亡是形态学概念。细胞的主动性死亡都同时符合程序性细胞死亡和细胞凋亡的定义,以致许多学者把凋亡及程序性死亡两个名词等同使
5、用。但Wylie（1984）观察到一些确定是程序性死亡的细胞只表现少数目前已被公认的凋亡过程的特点,其后不少报告进一步证实某些细胞表现出明显不同于凋亡过程的程序性死亡,虽然这两种不同类型的死亡都需要特殊信息启动,都需要有新的基因表达,但一旦细胞开始进入死亡程序,其过程便有差异,例如 T 细胞的死亡属于凋亡,其特点是膜肿胀,染色质凝聚于边缘,染色质DNA断裂成碎片;但神经细胞的程序性死亡却不出现这些特点,而是表现膜皱陷,核固缩,DNA保持不变。对这两种不同的表现有两种解释:一种认为凋亡可能包括若干不同的过程,而T细胞与神经元的凋亡可能各代表其中的一种;另一种解释是认为神经元并不进行凋亡,而是执行
6、另一种不同的分子机制。还有一些学者认为可能存在一种以上的调控程序性死亡的途径,而凋亡可能是其中的主要途径。程序性细胞死亡的基因性程序的本质是特殊的定时自杀，而凋亡则可被多种外源因素及病理因素所诱发，故弄清程序性细胞死亡与凋亡的关系是必要的。凋亡是指一种特殊形式的细胞死亡，并已从形态学和生物化学角度对其特点予以界定，看来把细胞凋亡与程序性细胞死亡这两个名词完全等同是不恰当的,有必要对二者的异同及关系进一步深入研究。三.细胞凋亡的生物学特征细胞凋亡的生物学特征 形态学变化 生物化学变化 DNA片段化 大分子的合成 tTG（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高的水平。细胞凋亡的形态特征（1）凋亡的起始
7、；微绒毛的消失，细胞间接触的消失，与周围的细胞脱离，细胞质中，线拉体大体完整，染色质固缩，（2）细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，（3）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围。（4）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别 特征特征 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死 诱导因素诱导因素 生理及弱刺激生理及弱刺激 强烈刺激强烈刺激 受累范围受累范围 单个细胞丢失单个细胞丢失 成群细胞死亡成群细胞死亡 膜完整性
8、膜完整性 保持到晚期保持到晚期 早期即丧失早期即丧失 细胞体积细胞体积 减少减少、固缩固缩 增大肿胀增大肿胀 染色质染色质 凝聚成半月形凝聚成半月形 稀疏成网状稀疏成网状 细胞器细胞器 无明显变化无明显变化 肿张破坏肿张破坏 溶酶体溶酶体 保持完整保持完整 破坏外溢破坏外溢 细胞形状细胞形状 形成凋亡小体形成凋亡小体 破裂成碎片破裂成碎片 基因组基因组DNADNA 有控降解有控降解 随机降解随机降解 大分子合成大分子合成 一般需要一般需要 不需要不需要 基因调控基因调控 有有 无无 后果后果 不引起炎症反应不引起炎症反应 引起炎症反应引起炎症反应 意义意义 生理死亡方式生理死亡方式 病理死亡方
9、式病理死亡方式 生物化学特征生物化学特征 胞浆内胞浆内Ca2+浓度升高浓度升高。细胞内活性氧增多细胞内活性氧增多。质膜通透性变大质膜通透性变大。DNA内切酶活性被激活升高内切酶活性被激活升高，双链双链DNA在核小体之间在核小体之间切断形成切断形成180200bp为基数的有序片段为基数的有序片段。型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升活性升高高。细胞凋亡细胞凋亡DNA的片段化的片段化 凋亡相关因素凋亡相关因素 诱导性因素：激素和生长因子失衡诱导性因素：激素和生长因子失衡 理化因素：高温、强酸、强碱、抗癌药物理化因素：高温、强酸、强碱、抗癌药物 免疫性因素
10、免疫性因素 微生物学因素：细菌、病毒微生物学因素：细菌、病毒 抑制性因素抑制性因素:细胞因子：细胞因子：IL-2，神经生长因子，神经生长因子 某些激素某些激素 某些二价金属阳离子、药物某些二价金属阳离子、药物 凋亡的基因调控凋亡的基因调控 抑制凋亡基因：抑制凋亡基因：Bcl-2，EIB，IAP 促进凋亡基因：促进凋亡基因：P53，Bax，ICE 双向调控基因：双向调控基因：c-myc，Bcl-x 四.细胞凋亡的过程及机理 接受凋亡信号 凋亡调控分子间的相互作用 蛋白水解酶（caspases）的活化 凋亡的级联反应 细胞凋亡的两条通路：膜受体通路、线粒体通路细胞凋亡的两条通路：膜受体通路、线粒体
11、通路 膜受体的信号转导 参与死亡受体信号转导的接头蛋白：（死亡结构域蛋白death domain protein）TRADD：TNF受体相关死亡结构域蛋白 TNF+TNFRI（死亡结构域）+TRADD细胞凋亡 FADD：Fas相关死亡结构域蛋白 FasL+Fas（死亡结构域）+FADD 细胞凋亡 RIP：受体相互作用蛋白 CRADD：含有死亡结构域的caspase和RIP接头蛋白 MADD：活化MAP激酶的死亡结构域蛋白(一)细胞凋亡的膜受体通路 FASL+FAS +FADD 凋亡诱导复合物（DISC）胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上 细胞有足够caspase8 细胞caspas
12、e8浓度不够 死亡受体活化，切割Bid tBid从胞质到线粒体 细胞凋亡 CtyC 释放 线粒体与细胞凋亡 线粒体参与细胞凋亡或坏死的途径 释放caspase活化因子 细胞色素C：细胞色素C+Apaf-1+caspase9凋亡体 AIF（凋亡诱导因子）Caspase3 Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子 (二)线粒体通路 五五.凋亡的效应分子凋亡的效应分子 细胞凋亡的分子机制分子机制虽然还不十分清楚，但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。半胱氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽键，因此又称之为Ca
13、spases(取英文Cysteine C，aspartic acid，Asp，proteases的词头)Caspase家族的结构与分类 ICE亚类Caspase蛋白酶：ICE是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶，参与凋亡但不起主要作用；Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11 Caspase12，Caspase13，Caspase14。凋亡启动亚类Caspase蛋白酶：Caspase8，Caspase2，Caspase 9，Caspase10。凋亡效应亚类Caspase蛋白酶：Caspase3，Caspase6，Caspase7 Caspase家族的特点 以酶原
14、的形式存在，需要活化：同源活化和异源活化,活化后形成四聚体的蛋白水解酶，发挥生物学作用 C端同源区存在半光氨酸激活位点 Caspase分：启动酶和效应酶 Caspase活化机制：Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，虽然分子各异，但是它们活化的过程相似。首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成的有活性的四聚体,Caspase的效应机制 凋亡细胞的特征性表现，包括DNA裂解为200bp左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化，细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，然后，这些凋亡小体被其他细胞所吞
15、噬。破坏细胞抗凋亡因素 破坏细胞结构 影响核酸的结构与功能 破坏细胞抗凋亡因素 正常活细胞因核酸酶处于无活性状态，这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化。现知caspase可以裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物称为ICAD。有意义的是CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性，因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需要的。破坏细胞结构 Caspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（Lamin）是由核纤层蛋
16、白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。6 影响核酸的结构与功能 Caspase可作用于多种与DNA，RNA功能有关的蛋白如灭活或下调与DNA修复有关的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白。由于DNA的作用，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。六.细胞凋亡的调节 1.Bcl1.Bcl-2 2家族家族 （B cell lymphoma/leukemiaB cell lymphoma/leukemia-2 2）B B细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤/白血病白血病-2)Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,而不是促进细胞的增殖。Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。蛋白含有4个Bcl-2同源结构域，依次命 名为BHl、BH2、BH3和BH4。可分为3个亚族：BclBcl-2 2亚家族亚
