1、ICS 13.020.01 CCS Z 01 DB11 北京市地方标准 DB11/T 20232022 鱼类贝类环境 DNA 识别技术规范 Technical regulations for fish and shellfish identification using environmental DNA 2022-09-29 发布 2023-01-01 实施北京市市场监督管理局 发 布 DB11/T 20232022 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 鱼类贝类 eDNA 识别程序.2 5 试剂和器具.2 6 水样采集.4 7 水样富集.5
2、8 DNA 提取和纯化.5 9 PCR 扩增.6 10 测序及结果分析.7 11 质量保证与质量控制.8 附录 A（资料性）8 碱基条形码参考序列.9 参考文献.10 DB11/T 20232022 II 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由北京市水务局提出并归口。本文件由北京市水务局组织实施。本文件起草单位：北京市水文总站（北京市水务局水质水生态监测中心）、中国科学院生态环境研究中心、首都师范大学。本文件主要起草人：黄振芳、刘波、杨蓉、李世国、王忠锁、王东霞、徐斌、赵红磊、叶燕慧、郭伟、徐冉、唐女、孙春媛、张满富、吕
3、喆、王浩、王玉璠、吴玉梅、王雪莲、刘芳、焦振寰、陶亮、薛晨旺。DB11/T 20232022 1 鱼类贝类环境 DNA 识别技术规范 1 范围 本文件规定了鱼类贝类环境DNA（eDNA）识别的对象、技术方法、采集和实验分析等技术要求。本文件适用于河流、湖泊、水库和渠道等地表水域的鱼类和贝类eDNA识别。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SL 219 水环境监测规范 3 术语和定
4、义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 鱼类 fish 以鳃呼吸、凭上下颌摄食并通过尾和躯干摆动以及鳍的协调作用游泳的水生脊椎动物，是软骨鱼纲和硬骨鱼纲动物的统称。3.2 贝类 shellfish 具三胚层、真体腔的软体动物，为底栖动物中的重要功能类群，主要包括双壳类（如蚌类、贻贝）和腹足类（如螺类）。3.3 环境 DNA environmental DNA(eDNA)从生物生活环境中直接提取到的不同物种DNA的总和，包含动植物脱落的细胞或游离的DNA，可提供一个环境中生活物种的存在记录。3.4 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction(PCR)一种用于扩增特定DNA
5、片段的分子生物学技术，包括变性、退火、延伸等主要步骤。DB11/T 20232022 2 3.5 分类操作单元 operational taxonomic unit(OTU)在系统发生学或群体遗传学研究中设定的特定标志，可鉴别生物分类单元（品系、种、属等）。一般把碱基序列相似度不小于97%的OTU定义为一个物种。3.6 引物条形码 barcode 为高通量测序时区分不同样点来源的物种基因序列，在扩增引物5端增加的序列特异性短片段标记。4 鱼类贝类 eDNA 识别程序 鱼类贝类eDNA识别程序见图1。图1 鱼类贝类 eDNA 识别程序 5 试剂和器具 5.1 试剂 除非另有说明，试剂均使用符合国
6、家标准的分析纯试剂，试验用水均使用满足GB/T 6682中一级水要求的新制备的超纯水。具体要求如下：次氯酸钠：化学纯；消毒液：次氯酸钠和蒸馏水配制，有效氯浓度 5.5%6.5%（质量分数）；DB11/T 20232022 3 无水乙醇：化学纯，分析纯；75%乙醇：无水乙醇和超纯水 3:1 配制，其中消毒用 75%乙醇可使用化学纯无水乙醇和蒸馏水3:1 配制；70%乙醇：无水乙醇和超纯水 7:3 配制；乙二胺四乙酸（EDTA）；氢氧化钠（NaOH）；EDTA 溶液，（EDTA）=0.02 mol/L：称取 5.8448 g EDTA 溶于适量超纯水中，NaOH 固体调节 pH 至 8.0，定容至
7、 1000 mL，121灭菌 18 min，冷却后常温保存；EDTA 溶液，（EDTA）=0.5 mol/L：称取 14.612 g EDTA 溶于适量超纯水中，NaOH 固体调节 pH 至 8.0，定容至 100 mL，121灭菌 18 min，冷却后常温保存；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）；浓盐酸；Tris-HCl 溶液，（Tris-HCl）=0.1 mol/L：称取 15.76 g Tris-HCl 溶于适量超纯水中，浓盐酸调节 pH 至 8.0，定容至 1000 mL，121灭菌 18 min，冷却后常温保存；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠（NaCl）；CTAB
8、提取液：称取 4 g CTAB 和 16.38 g NaCl，分别溶于适量超纯水中，加入 0.02 mol/L EDTA溶液 8mL 和 0.1 mol/L Tris-HCl 溶液 20 mL，定容至 200 mL，121灭菌 18 min，冷却后常温保存；蛋白酶 K：酶活力单位为 20；Tris 饱和酚，pH7.8；氯仿；异戊醇；酚氯仿：Tris 饱和酚、氯仿和异戊醇按 25:24:1 体积比配制；乙酸铵（CH3COONH4）；乙酸铵溶液，（CH3COONH4）=7.5 mol/L：称取 5.78 g 乙酸铵溶于 10 mL 超纯水中；乙酸钠（CH3COONa3H2O）；乙酸钠溶液，（CH3
9、COONa）=3 mol/L：称取 102.06 g 乙酸钠溶于适量超纯水中，冰醋酸调节 pH 至 5.2，定容至 250 mL，分装后 121灭菌 18 min；动物组织细胞 DNA 提取试剂盒：主要包括样品裂解液、DNA 沉淀试剂、DNA 洗涤试剂、DNA溶解试剂、纯化柱等，提取的 DNA 要求 OD260/280 比值介于 1.82.0 之间，OD260/230 比值大于 2.0；柱式 PCR 产物纯化试剂盒：主要包括 DNA 溶解试剂、纯化柱、DNA 沉淀试剂、DNA 洗涤试剂等，纯化的 DNA 要求 OD260/280 比值介于 1.82.0 之间，OD260/230 比值大于 2.
10、0；PCR 聚合酶：碱基错配率低于 10-6；脱氧核糖核苷三磷酸：脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟嘌呤三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸的等摩尔数混合物（各 2.510-3 mol/L），纯度 98%；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；硼酸；Tris-硼酸电泳缓冲液（TBE，5）：称取 54 g Tris 和 27.5 g 硼酸溶于适量超纯水中，加入 0.5 mol/L EDTA 溶液 20 mL，定容至 1000 mL，121灭菌 18 min，冷却后常温保存；琼脂糖：电泳级；溴化乙锭（EB）；DB11/T 20232022 4 2.0%琼脂糖凝胶：量取 5TBE 缓冲液 20 mL，加入超纯水 18
11、0 mL 和 4 g 琼脂糖，加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，待琼脂糖胶液冷却至 5060时加入 0.1 mg EB，倒入电泳槽中，待胶完全冷却凝固后备用；DNA 分子量标准品：范围 0100 bp。5.2 主要器具 具体要求如下：车载冰箱：温控 4及以下；采样瓶：1 L，塑料或玻璃材质，具螺旋帽或磨口塞，使用前 121灭菌 18 min；微量移液器：0.2 L 2 L、1 L 10 L、20 L 200 L、100 L 1000 L；真空抽滤泵及过滤砂芯；冰箱：温控-20；高压蒸汽灭菌器：可达到标准要求的 121及 18 min 灭菌条件；混合纤维素酯滤膜：孔径 0.45 m；手术剪；尖头镊
12、子；离心管：1.5 mL，无 DNA 酶；PCR 管：200 L；超微量紫外分光光度计：最小测量体积不高于 1 L，波长范围包括 230 nm、260 nm 和 280 nm，检出限 2 ng/L(dsDNA)；PCR 仪：温控范围 0100，升温速度 6/s，配套 PCR 管 200 L；低温离心机：最高离心转速不低于 13000 rpm，温控范围低至 4；凝胶成像分析系统：302 nm 光源；电泳仪：水平式；电泳槽：水平式。6 水样采集 6.1 采样点设置 eDNA采样点的布设应遵循以下原则：a)主要考虑不同植被覆盖、水文条件和底质特征设置样点，兼顾近岸浅水水域和离岸开阔水域；b)湖泊型水
13、体：每 2 km2设置不少于 1 个采样点；c)水库型水体：入库河口区应设置采样点，库区每 15 km220 km2设置不少于 1 个采样点；d)河流型水体：参照 SL 219 中水质监测断面布设原则设置采样断面；对鱼类 eDNA 样品，在采样断面上、中、下游间隔 500 m 以上等比采集混合水样；对贝类 eDNA 样品，河流宽度50 m时在两岸近岸水域布设 2 个采样点，河流宽度50 m 时在两岸近岸水域和中间共布设 3 个采样点，等比采集混合水样。6.2 采集方式 6.2.1 近岸样点：鱼类 eDNA 样品在距岸 5 m 内、不受泥沙干扰的区域采集，贝类 eDNA 样品在距岸0.5 m 处
14、采集。采样人佩戴一次性乳胶手套，将 1 L 的灭菌采样瓶瓶口向上游来水方向，在距水面下 0.5 m 范围内采集 1 L 水样。DB11/T 20232022 5 6.2.2 离岸样点：鱼类 eDNA 样品在水深10 m 处水面下 0.5 m 采集，水深10 m 处分水面下 0.5 m和水底上 1 m 两个水层等比采集混合水样；贝类 eDNA 样品在水底上 0.5 m 范围内采集。采样人乘船于船行进方向前侧用采水器采集 1 L 水样，转移至灭菌采样瓶中。6.2.3 采样瓶装满后应密封并做好标记，置于车载冰箱 4冷藏运输。7 水样富集 7.1 器具消毒 7.1.1 宜根据样品数准备足量器具，统一消
15、毒备用。7.1.2 抽滤器和废液瓶需用自来水冲洗，并置于消毒液中浸泡 30 min，取出用自来水冲净后超纯水浸洗 10 min，烘干备用。7.1.3 剪刀和镊子用自来水和 75%乙醇清洗，超纯水浸洗，烘干备用。7.1.4 1.5 mL 离心管经 121灭菌 18 min，烘干备用。7.2 水样抽滤 7.2.1 连接真空泵和抽滤器，用镊子取 0.45 m 孔径的混合纤维素酯滤膜置于玻璃滤膜台中央，盖上抽滤漏斗。7.2.2 取 1 L 灭菌超纯水进行抽滤，完成后用灭菌镊子从边缘夹起滤膜并折叠放入 1.5 mL 离心管中，作为抽滤对照组。采用相同方法抽滤采样空白对照作为采样对照组。采用相同方法抽滤各
16、采样点水样作为实验组。水样浊度高造成滤膜堵塞时应及时更换滤膜，更换过程应避免水样损失。抽滤中保持抽滤器密封，每抽滤完一个水样应清洗抽滤器并消毒。7.2.3 水样 4冷藏存放不超过 24 h，应于采集当天完成抽滤。7.2.4 抽滤后的滤膜均在-20冰箱中保存，宜在 7 天内完成 DNA 提取。8 DNA 提取和纯化 8.1 DNA 提取 具体要求如下：a)用灭菌剪刀将收集的滤膜剪碎至 1 mm23 mm2的碎片，置于 1.5 mL 离心管中；b)向离心管中加入 750 L CTAB 提取液和 20 L 蛋白酶 K，涡旋震荡混匀，在 56水浴锅中水浴裂解 3 h，期间每隔 0.5 h 进行间断性震荡；c)将裂解液转移到对应编号的新离心管中，加入等体积 Tris 饱和酚，混匀，4、13000 rpm 离心 10 min；d)转移上清液到对应编号的新离心管中，加入等体积酚氯仿，混匀，4、13000 rpm 离心 10 min；e)转移上清液到对应编号的新离心管中，加入 2 倍体积冷冻处理的无水乙醇和 50 L 7.5 mol/L的乙酸铵溶液，混匀，-20放置 30 min；f)4、13000
