1、细胞周期调控 生物工程学院 王丹 MPF的发现及其作用:MPF,即卵细胞促成熟因子(maturation-promoting factor),或细胞促分裂因子(mitosis-promoting factor),或M期促进因子(M phase-promoting factor).背景一:Rao和Johnson(1970、1972、1974)将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞在灭活仙台病毒介导下诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的染色体凝集,称之为染色体超前凝集(prematurely condensed chromosome，PCC)。如图所示:G1期PCC为单
2、线状，S期PCC为粉末状，G2期PCC为双线染色体，因DNA未复制;因DNA由多个部位开始复制;说明DNA复制已完成。人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，称为细胞促分裂因子。不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生:背景二：1971年,Masui和Markert用非洲爪蟾做实验，明确提出了MPF这一概念。非洲爪蟾卵细胞发育过程分为六个阶段、和期。前四个时期为卵母细胞生成和生长阶段。其中 第期时细胞核较大，称为生发泡(germinal vesicle,GV),此时细胞就停留在该时期，等待成
3、熟。因此，在成熟卵细胞的细胞质中必然有一种物质，可以诱导卵母细胞成熟，称之为促成熟因子，MPF。进一步实验表明：在成熟卵母细胞中，MPF已经存在，只是处于非活性状态，称为前体MPF(preMPF)。非活性态的前体MPF通过翻译后修饰，可以转化为活性态的MPF。分离纯化出MPF：直到1988年，Maller实验室的Lohka等人才以非洲爪蟾为材料，分离得到了微克级的纯化的MPF。证明其含有p32和p45两种蛋白。二者结合后表现出蛋白激酶活性，可以使多种蛋白质底物磷酸化。证明，MPF是一种蛋白激酶。p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系：另一批生物学家以酵母为材料,从另一个侧面对细胞周期调控进
4、行着深入研究.如:L.Hartwell以芽殖酵母为实验材料,P.Nurse以裂殖酵母为实验材料。他们的实验原理都相同：均是在不同温度下培养酵母,获得不同的温度敏感突变体,这些不同的突变体在限定温度下，会滞留在细胞周期的某个阶段以及表现出不同的形态结构。这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为(cell division cycle)cdc基因，根据被发现的先后顺序被命名。P.Nurse在裂殖酵母中发现的cdc2基因就是第一个被分离出来的cdc基因。其表达产物是一种相对分子量为34103的蛋白，被称为p34cdc2,进一步研究发现，p34cdc2具有激酶活性，可使多种蛋白底物磷酸化，在裂殖酵母周
5、期调控中起关键性调节作用。L.Hartwell在芽殖酵母中发现的cdc28基因是第二个被分离出的cdc基因，其表达产物也是一种相对分子量为34103的蛋白，被称为p34cdc28，它也是一种蛋白激酶，在G2/M转换过程中起中心调节作用。由此得出p34cdc2与p34cdc28是同源物。进一步研究发现：二者本身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白结合后，其激酶活性才能够表现出来。例如：p34cdc2必须与另一种蛋白p56cdc13结合后才具有激酶活性。很快MallerNurse证明：MPF中的p32可以被p34cdc2特异抗体所识别，并且p34cdc2多肽片断可以加速MPF活性，表明二者是同源物
6、。Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。芽殖酵母及其细胞周期 裂殖酵母及其细胞周期 在研究酵母的同时，以Tim Hunt为代表的另一批科学家正在以海胆卵为材料，对细胞周期调控进行着深入研究。他们发现：有两种蛋白质的含量随细胞周期进程的变化而变化，一般在细胞间期内积累，在细胞分裂期内消失，在下一个周期中又重复这一消长现象。因此称这两种蛋白为细胞周期蛋白(cyclin)。并很快被分离和克隆出来，证明其广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中，而且在功能上存在互补性。MallerHunt合作证
7、明：MPF中的另一种成分是周期蛋白B。序列分析证明，周期蛋白B与酵母的p56cdc13是同源物。由此MPF的生化成分得到确定：MPF=p34cdc2 +cyclinB （催化亚单位）（调节亚单位）2001年10月8日美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖 周期蛋白：自1983年首次发现周期蛋白后，许多科学家纷纷开展周期蛋白研究，短短10年就从各种生物中克隆分离了数十种周期蛋白，如酵母的Cln1、Cln2、Cln3、Clb1-Clb6，高等动物的周期蛋白A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、
8、F、G、H等等。各种周期蛋白均含有100个左右的保守氨基酸序列，称为周期蛋白框，它可介导周期蛋白与CDK结合。M期周期蛋白(A2,B1)分子的N端含有破坏框。G1期周期蛋白分子的C端含有一个PEST序列。部分周期蛋白分子结构特征部分周期蛋白分子结构特征 图中除Cln3外，均为人的周期蛋白分子，所有这些分子均含有一个周期蛋白框。细胞周期蛋白的细胞周期蛋白的破坏框破坏框与降解途径与降解途径 G1周期蛋白也通过类似的途径降解，但其N端没有破坏框，C端有一段PEST序列与其降解有关。部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与期中的积累及其与CDK激酶活性的关系。激酶活性的关系。不同周期蛋白的表达时期不同，与不同的CDK结合，调节不同CDK激酶的活性。
