1、细胞凋亡及其相关进展 昆明医学院神经科学研究所 殷露玮 1.细胞凋亡的概述 2.细胞凋亡的信号转导途径 3.重要的凋亡调控基因 4.常见细胞凋亡检测方法 内内 容容 细胞凋亡的概述 一、细胞凋亡的概念 1 凋亡概念的形成 1972年，Kerr发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一 些细胞体积收缩、染色质凝集。这些细胞从其周围的组织中脱落并被吞噬且机体无炎症 反 应。1972 年 Kerr 等 首 次 提 出 了 细 胞 凋 亡(Apoptosis)的概念。Apoptosis一词来源于希腊，原意指秋天树叶的凋落以及花瓣的散落，其语源是apo(off,离去之意),ptosis(falli
2、ng，凋落之意）。英国人悉尼布雷内、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，。（2002年）“for their discoveries concering genetic regulation of organ of development and programmed cell death”英国科学家悉尼布雷内。1951年在南非威特沃特斯兰大学完成了他的硕士学业，1954年取得英国牛津大学博士学位，现任职于美国加利福尼亚州伯克利的分子科学研究所。他选择线虫作为新颖的实验生物模型，这种独特的方法使得基因分析能够和细胞的分裂、分化，以及器官的发育联系起来，并且能够通过显微镜追踪这一系列过程。布
3、雷内在英国剑桥完成的这些发现为他获得诺贝尔奖奠定了基础。秀丽隐杆线虫 1090131959（cells）属无脊椎动物 线形动物门 线虫纲 个头小1mm 最大特点：体细胞数恒定 发现线虫ced3 4 9基因直接与细胞凋亡相关，而且这些基因在高等哺乳类动物也有普遍意义。2细胞凋亡的概念 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因严格控制的细胞自主的有序死亡。也常常被称为细胞程序死亡（programmed cell death）凋亡细胞被吞噬细胞吞噬。4细胞凋亡与细胞程序性死亡的区别 细胞凋亡一词出现之前的1965年，Lockshin等在研究蛾的变态发育过程中已发现存在着细胞程序性死亡（Programme
4、d cell death，PCD）现象。PCD是个功能性的概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中,一个预定的并受到严格程序控制的正常组成部分。细胞凋亡则是一个形态学的概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。3细胞凋亡的生理意义 组织分化、器官发育 免疫系统的动态平衡（损伤修复和衰老细胞的清除）抵御外界各种因素干扰 举例：1.胸腺 2.哺乳期乳腺发育 凋亡时细胞的形态学改变 空泡化空泡化 固固缩缩 出芽出芽 边集边集 凋亡小体凋亡小体 DAPI即4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole)是一种能够与DNA中大
5、部分A A，T T碱基相互结合的荧光染料碱基相互结合的荧光染料常用与荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜它可以用于活细胞和固定细胞的染色。荧光染料标记(Hoechst33342、PI)的凋亡细胞(染色质凝聚).流式细胞仪鉴别:正常细胞:低蓝(hocehest+)/低红(PI+);凋亡细胞:高蓝(hocehest+)/低红(PI+）坏死细胞:低蓝(hocehest+)/高红(PI+);二、细胞凋亡的形态学及生化特征 1细胞凋亡的形态学特征 往往涉及单个细胞。凋亡细胞连接消失，与周围的细胞脱落。细胞体积变小(皱缩)，细胞质浓缩。胞膜结构完整，有泡状突起。细胞核染色质浓缩，聚集核膜周围。
6、在胞浆中出现由降解的胞浆和胞核成分包裹于膜性成分中形成的凋亡小体(Apoptotic bodies)。无内容物外溢，因而不引起周围的炎症反应。生化特征 细胞色素细胞色素C诱导细胞凋亡不同时间诱导细胞凋亡不同时间DNA电泳图电泳图 生化特征 1 胞浆内Ca2+浓度升高(继而激活核酸内切酶发生最早)。2 细胞内活性氧增多。3 RNA/蛋白质合成(说明凋亡是主动耗能过程与某些基因表达变化有关)。4 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段。5 型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。注：型谷氨酰胺转移酶是Ca2+依赖酶，可促进蛋白质谷氨酰胺
7、与赖氨酸残基之间的交联，使细胞膜出现凹陷、皱缩，促进凋亡小体的形成。另外丝氨酸蛋白酶（如粒酶B),一氧化氮合酶（NOS),PARP,calpain,等也参与细胞的凋亡过程。细胞凋亡的生化改变 和凋亡有关的两个酶 DNase 作用：切割染色质DNA 特点：Ca2+/Mg2+增强活性，Zn2+抑制其活 Casepases 作用：灭活凋亡抑制物 水解蛋白质结构，形成凋亡小体 水解凋亡相关活性蛋白 特点：一类特异的在天冬氨酸之后切割靶蛋白的半胱氨酸蛋白酶家族（cysteine-containing aspartate-specific protease）细胞坏死的概述 一般过程：因补体反应或烈性病毒感
8、染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症反应。3细胞凋亡与细胞坏死的区别 细胞坏死 细胞凋亡 细胞形态 肿胀 皱缩 胞 浆 肿胀 浓缩 胞 膜 受损 完整、泡状 核染色质 染色质不规则,移位 浓缩聚集核膜周 DNA断裂方式 不规则 在核小体间整倍性断裂 结 局 崩溃 凋亡小体 诱导原因 病理 生理或病理 基因调控 -+炎症反应 有 无 坏死细胞 凋亡细胞 细胞凋亡的过程 大致分为如下四个阶段：凋亡信号转导
9、凋亡基因激活 凋亡的执行 凋亡细胞的清除 诱导细胞凋亡的因子诱导细胞凋亡的因子 物理性因子：射线物理性因子：射线(紫外线紫外线 X X射线等射线等)，较温，较温和的温度刺激和的温度刺激(如热激如热激 冷激冷激)等等 化学及生物因子：活性氧基团和分子化学及生物因子：活性氧基团和分子,DNA,DNA和和蛋白质合成的抑制剂蛋白质合成的抑制剂,激素激素,细胞生长因子缺失细胞生长因子缺失,肿肿瘤坏死因子（瘤坏死因子（TNF)TNF)细胞凋亡的分子调控机理 线虫（线虫（C.clengansC.clengans）凋亡研究发现）凋亡研究发现ced3 ced3、ced4ced4基因基因促进细胞凋亡，促进细胞凋亡
10、，ced9ced9基因阻止基因阻止ced3 /ced4ced3 /ced4的激活，抑的激活，抑制细胞凋亡。制细胞凋亡。Ced3Ced3哺乳类同源物是哺乳类同源物是ICEICE（interleukininterleukin1 1convering enzymeconvering enzyme）即即CaspaseCaspase-1 1 Ced4 Ced4 哺乳类同源物哺乳类同源物 9797年被证实为年被证实为ApafApaf-1(apoptosis protease activting factor)1(apoptosis protease activting factor)一种细胞一种细胞凋亡蛋
11、白酶活化因子）凋亡蛋白酶活化因子）CedCed-9 9哺乳类对应物较早证实为哺乳类对应物较早证实为BclBcl-2 2 总结总结:ced3:ced3杀手基因杀手基因 ced4ced4即使杀手基因又是存活基因且为两者的联系即使杀手基因又是存活基因且为两者的联系因子因子 ced9ced9存活基因存活基因 细胞凋亡的信号转导途径 细胞凋亡的过程：接受凋亡信号 凋 亡 调 控 子 间 的 相 互 作 用 Caspase激活和级联反应 死 亡 底 物 的 活 化 细胞凋亡 细胞凋亡信号转导的两大途径：由死亡受体(Fas、TNFR)介导的外源途径。在这条途径中，caspase-8首先被激活；线 粒 体 介
12、 导 的 内 源 途 径。在 这 条 途 径 中，caspase-9首先被激活。细胞凋亡后期的共同途径：Caspase的激活。凋亡过程如何发生？CaspaseCaspase致细胞凋亡变化机制致细胞凋亡变化机制 1凋亡抑制物凋亡抑制物 正常活细胞核酸酶和抑制物结合正常活细胞核酸酶和抑制物结合 CADCAD-ICAD ICAD，CaspaseCaspase激活的脱激活的脱氧核糖核酸酶（氧核糖核酸酶（caspasecaspase-activatedactivated deoxyribonuleasedeoxyribonulease CADCAD）2 2破坏细胞结构破坏细胞结构 核纤层蛋白核纤层蛋白(
13、核膜的骨架结构核膜的骨架结构)作为底物被作为底物被CaspaseCaspase裂解裂解 染色质染色质的固缩的固缩 3 3调节蛋白丧失功能调节蛋白丧失功能 作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白，改变细胞结构作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白，改变细胞结构 DNADNA修复有关的酶、修复有关的酶、mRNAmRNA剪切蛋白和剪切蛋白和DNADNA交联蛋白交联蛋白 胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径 一一、死亡受体介导的凋亡途经死亡受体介导的凋亡途经（外源途径外源途径）死亡受体均属于死亡受体均属于肿瘤坏死因子受体肿瘤坏死因子受体（TNFRTNFR）超家族超家族，它们与相
14、应的配体它们与相应的配体（LigandLigand）结合后信结合后信号分子相互聚集并于细胞内衔接蛋白号分子相互聚集并于细胞内衔接蛋白（adapotoradapotor proteinprotein）结合结合，这些衔接蛋白又募集在受体部这些衔接蛋白又募集在受体部ProcaspaseProcaspase相互活化产生级联反应相互活化产生级联反应，使细胞凋亡使细胞凋亡。下游Caspase活化后，作用于底物，核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解Dnase结合蛋白，使Dnase释放，降解DNA形成DNA ladder；裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白,使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜质
15、PS重排,便于吞噬细胞识别并吞噬。TNFR超家族成员及其配体分子主要包括 Fas(又称CD95)/FasL、TNFR/TNF、DR3及TRAILR/TRAIL。死亡受体介导的凋亡途经示意图 二、线粒体介导的凋亡途经 线粒体不仅是细胞能量代谢的中心，而且在起源于细胞内部的死亡信号所诱导的细胞凋亡中处于中心位置。这些细胞内部的死亡信号源自 各种因素，如DNA损伤、氧化压力、X-射线、化疗药物、营养缺乏等 等。因而，线粒体所介导的凋亡途径又称为细胞凋亡的内源途径，其过程大致如下:1线粒体渗透转运孔（PTP）的开放和线粒体跨膜电位（）的消失，BclBcl-2 2家族蛋白对于家族蛋白对于PTPT孔的开放
16、和孔的开放和关闭起关键的调节作用关闭起关键的调节作用 2.细胞色素c从线粒体中的释放和Caspase-9的激活.凋亡信号转导途径 2004年4月21日，美国科学院宣布，王晓东被选为该院院士，这是美国科学界的最高荣誉。在目前的美国科学院院士中，42岁的王晓东是最年轻的一位。主要研究领域：细胞凋亡的生化途径。凋亡的调控 细胞凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如 Caspase家族、Bcl-2家族、抑癌基因P53、IAP家族等。抑制凋亡基因：Bcl-2，IAP（凋亡抑制蛋白）促进凋亡基因：wtP53，Bax，ICE（caspases亚型）双向调控基因：c-myc，Bcl-x 一、Caspase是凋亡的执行者 Caspase(Cysteine aspartatic acic specific protease)：在特异的天冬氨酸之后切割靶蛋白的一类进化上保守的半胱氨酸蛋白酶。又称半胱天冬酶（胱冬蛋白酶）。1Caspase家族特征 Caspase通 常以酶原（Procaspase）的形式存在，相对分子质量为29-49kD。N末端具有一个原结构域（Prodomain），C端同
