1、LOGOLOGO 第六节第六节 植物细胞的选育与改良植物细胞的选育与改良 筛选、诱变筛选、诱变 原生质体融合、基因重组原生质体融合、基因重组 CELLCELL Company Logo 为什么进行植物细胞的筛选?植物细胞往往不均一，会显示出不同的特性，需要将具有优良特性的细胞选择出来。植物细胞在培养过程中会发生变异，通过筛选将有利的变异细胞选出，而把不利的变异细胞去除。诱变获得的突变体，通过原生质体融合获得的融合子和通过基因重组获得的工程细胞 Company Logo 自发突变 体细胞无性系变异：植物细胞在体外培养过程中往往发生不可期的突变，且突变性状可以稳定遗传。其变异可发生在单基因控制的性
2、状上，也可以发生在多基因控制的性状上，而且可同时发生在胞质基因和核基因控制的性状上。染色体数目发生改变，或染色体结构发生改变如染色体易位、缺失、倒位、点突变等。造成这些改变的原因，普遍认为是由培养条件和培养基成分尤其是激素如2，4-D、细胞分裂素引起的。自发突变的频率约为10-810-5 变异的类型(从表型上)主要表现在：生长习性、株高、主茎长、主枝数、产量、花色、抗除草剂、抗旱、抗盐、抗寒、代谢产物突变、抗病、抗虫 Company Logo 诱发突变 提高突变频率到10-3 物理法和化学法：X射线、射线、紫外线、中子、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基脲等。 Company Logo 植物细胞突
3、变体的应用植物细胞突变体的应用 为细胞杂交和基因导入提供选择标记如携带标记基因Gus的细胞系 细胞、分子水平的遗传和代谢研究 对农作物性状进行遗传改良 提高植物细胞中有用代谢产物的含量 从组织水平和细胞水平上筛选突变体，较之整体植物有许多优点 LOGOLOGO 植物细胞筛选的方法植物细胞筛选的方法 小细胞团筛选法 选择压力筛选法 CELLCELL Company Logo 小细胞团筛选法 制备得到单细胞，在常规的培养基中经过单细胞培养，形成细胞团，通过观测细胞团的形态、颜色或者测定细胞代谢物的种类和含量，从而选出所需的细胞。实例 筛选花色苷含量高的玫瑰茄细胞 Company Logo 选择压力
4、筛选法 通过添加某些对不同的细胞有不同作用效果的物质，淘汰部分敏感细胞，而选择得到所需的细胞。正选择：把受选择的细胞群体臵于一定的选择压力之下，部分细胞在选择压力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗选择压力的细胞可以生长，从而选择得到所需的细胞。一步和多步选择 NaCl为选择剂选择耐盐突变体 以除草剂为选择剂选择抗除草剂突变体 负选择：选择的对象是在一定选择压力的作用下不能生长的那些细胞，而能够生长的细胞受到淘汰。适用于对营养缺陷型突变体的选择。 Company Logo 选择压力筛选法 直接选择：所用的选择压力正是以后在整体植株水平上突变表现型的作用对象。实例：抗性突变体的选择，用生长抑制剂如抗
5、生素、代谢类似物、某些金属及非金属离子等，来分离培养植物细胞，从中选择对生长抑制剂具有抗性的突变细胞，关键是对生长抑制剂浓度的选择。间接选择：选择压力不是突变表现型对其直接表现抗性的物质。实例：营养缺陷突变体、温度敏感型突变体及抗旱细胞突变体等的筛选 Company Logo 影响细胞筛选效果的因素 亲本材料对筛选效果的影响 培养方式对细胞筛选效果的影响 愈伤组织培养：生长速率比较慢；并非所有的细胞都能与培养基直接接触；细胞之间的接触相当紧密；细胞悬浮培养：以大小不一的细胞团形式存在；释放的有毒物的影响较大；原生质体培养：分离和培养技术还不完善；细胞生长速度对细胞筛选效果的影响 选择压力的施加
6、方式对细胞筛选效果的影响 一次性施加和逐步施加 LOGOLOGO 植物细胞的诱变 物理诱变 化学诱变 CELLCELL Company Logo 诱变的概念、形式 诱变：指通过各种诱变剂的作用，使细胞发生变异的过程，是获得优良植物细胞的有效方法之一。物理诱变剂包括X射线、射线、中子、a粒子、粒子、紫外线等。紫外线的能量较低，不能引起被照射物质的离子化，因而叫做非电离诱变因子；其余的物理诱变剂均能引起被照射物质的离子化，称为电离诱变因子。化学诱变剂的种类较多，根据对DNA的作用特点，主要分三类，包括碱基类似物、烷化剂、叠氮化合物。诱发配对错误/诱发染色体断裂/改变DNA的化学结构 Company
7、 Logo 如何进行诱变 诱变的基本过程：单细胞制备、预培养、诱发突变、突变细胞株的选择 诱发突变一般采用平板培养法，并在培养基中加入某种选择因子，长时间饲喂培养植物细胞，使其发生拟定目标的突变。一般认为所得到的突变体只有满足以下条件，才能表明已发生真实的突变：离开选择压后变异表型保持稳定；突变体中具有相应变化了的基因产物或生理生化代谢上的差异；变异表型能够通过有性繁殖遗传，其中变异的性状遗传稳定性是鉴定突变体最为可靠的标准， Company Logo 植物细胞诱变实例 对氨基酸和氨基酸类似物抗性的选择 抗病细胞突变体的选择 抗除草剂细胞突变体的选择 植物抗盐细胞突变体的选择 抗低温(或高温)
8、突变体和抗旱突变体(抗逆境)高光效突变体/营养缺陷型细胞突变体的选择 LOGOLOGO 植物细胞原生质体融合 CELLCELL Company Logo 叶肉原生质体分离纯化 Company Logo 纯化后的叶肉原生质体 Company Logo(1)(1)(2)(3)(4)(5)过程示意图过程示意图 Company Logo 原生质体融合的方式 自体融合：指发生在同一个亲本原生质体之间的融合，结果得到“同核体”。异体融合是指由不同种的双亲原生质体发生融合，结果得到“异核体”。 Company Logo 原生质体融合的产物 I 对称杂种：亲本双方原生质体（包括核和质）完全融合在一起，相互之间
9、未发生排斥，杂种的体细胞染色体数目为双亲之和。不对称杂种：亲本双方原生质体发生部分融合，或发生了融合，但融合体在分裂过程中一方的部分核或质被排斥，因而其体细胞染色体数目达不到双亲之和。细胞质杂种：两种来源不同的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起。非对称融合技术已经成为主要的融合方式，方法主要是用射线照射供体的原生质体，钝化其细胞核，再和受体原生质体融合。 Company Logo 原生质体融合的产物 II 谐和的细胞杂种：具有双亲的全套染色体组，形成异源双二倍体。部分谐和的细胞杂种：原生质体融合时，双亲的染色体经逐步排斥，而这种排斥是非完全性的，但仍可发生少量染色体组的重组，
10、然后进入同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植株。异胞质体细胞杂种：异胞质体细胞杂种除了含本种之一的细胞核外，还含有异种的细胞质。嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体，发生了膜融合和胞质融合后，尚未发生核融合。双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物。 Company Logo 异核体或杂种细胞的选择 必须设计或建立一种体系，优先选择细胞杂种。即这种体系只允许异核细胞存活，淘汰双亲同核体。这种体系除能早期发生异核体外，还能促进异核体细胞的分裂和分化。 Company Logo 选择方法 根据物理特性的差异进行选择 可见标记法：利用亲本双方原生质体的物理性状，如大小、颜色与
11、漂浮密度等的差别作为选择依据。自动细胞分检仪的应用可以准确迅速将杂种细胞分开，提高了选择效率。荧光标记法：对于形态上彼此无法区分的原生质体融合形成的异核体来说，可将两种原生质体群体分别用不同的荧光染料标记，然后通过荧光显微镜检测和鉴别异核体。根据生长特性的差异进行选择 利用亲本双方在培养基上的分裂分化性能不同，来淘汰一方的原生质体，然后再将杂种细胞与亲本细胞分开。利用突变细胞系的互补来选择 基于亲本双方遗传和生理的互补作用来选择杂种。杂种细胞由于结合了双亲细胞的遗传物质，具有正常的代谢途径或能在筛选培养基生长增殖，而亲本细胞由于某些生理或遗传上的缺陷而不能生长，从而达到杂种细胞筛选的目的。常用
12、的互补选择主要包括叶绿素缺失互补、营养缺陷型互补、抗性互补和遗传互补等。 Company Logo 杂种细胞的培养及再生 抓住时机，及时把它转移到分化培养基上进行培养，使其恢复分化能力，诱导它分化出胚、苗和根，并长成完整的杂种植物。可以参照原生质体的培养方法进行培养。由于除去了细胞壁，培养基中必须有一定浓度的渗透压稳定剂来保持杂种细胞的稳定。培养方法有液体培养、固体培养和固液混合培养。常用液体培养，包括微滴培养和浅层培养。原生质体融合杂种细胞在适合的培养条件下，首先形成细胞壁，然后进行分裂，进而形成愈伤组织。 Company Logo 杂种细胞或杂种植株的鉴定 形态学指标 细胞学指标：核型（染
13、色体数目、大小、随体、着丝点位臵等）和带型（带、带、带等）分析 生化指标：同功酶谱分析，如酯酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等的同功酶；二磷酸核酮糖羧化酶分析和叶绿素DNA、线粒体DNA、核DNA的分析，采用5S rDNA间隔序列差异分析、Southern杂交、原位杂交和RFLP图谱分析。限制性片段长度多态性分析技术（RFLP）RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA。 Company Logo 马铃薯原生质体再生植株 Company Logo 白菜白菜 甘蓝甘蓝 白菜甘蓝白菜甘蓝 应用应用 LOGOLOGO 植物细胞的基因重组
14、与转移 外源基因的获取、载体的制备、基因的体外重组、基因的转移和外源基因的表达 CELLCELL Company Logo 植物细胞基因转移的方法 农杆菌介导法 直接转化法 基因枪法 电激法 显微注射法 脂质体介导法 病毒载体转导法 Company Logo 农杆菌介导法 利用农杆菌（Agrobacterium）的Ti或Ri质粒携带外源基因进入植物细胞（组织、器官或植株）的过程称为农杆菌介导的基因转移。植物细胞、组织、器官共培养法：该方法是以贺斯克（Horsch）等人1985年建立的叶盘法为基础发展起来的，是双子叶植物细胞基因转移的较为常用的简单有效的方法。植株感染法：一般采用种子实生苗或试管
15、苗作为外植体,在整体植株上造成创伤,然后把农杆菌接种于创伤面上,或用针头把农杆菌注射到植物体内,使其进行侵染转化。原生质体共培养法：是指将处于再生壁时期的原生质体与农杆菌一起共培养。 Company Logo 直接转化法 直接转化法：即用裸露的DNA经特殊处理后，直接转移到植物细胞和原生质体中，导致细胞转化的技术。基因枪法：是由克雷因（Klein）等在1987年建立的基因导入方法。其原理是将DNA包裹于微小的金属钨或金粒的表面，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或组织，使外源基因进入受体细胞核并整合表达的过程。化学药剂诱导法：植物的原生质体在没有载体的情况下，借助一些化学试剂的诱导能够吸
16、收外源DNA、质粒等遗传物质，并有可能整合到植物细胞染色体中去。电激法（electroporation）：又称电穿孔法，是在高压电脉冲作用下在新鲜分离的原生质体的质膜上形成可逆性的瞬间通道，从而发生外源DNA的摄取。显微注射法（microinjeceion）：这是利用特制的显微注射仪将外源遗传物质注入植物细胞的转化方法。低能离子束法（Ionimplantation）/激光束法 Company Logo 其他方法 花粉管通道转化法：利用开花植物授粉后形成的花粉管通道，在植物开花以后，去除柱头，直接利用外源的DNA进行涂抹，使外源的DNA借助业已形成的花粉管通道转入卵、合子或早期胚胎细胞，实现目的基因的转移。脂质体介导转化法 病毒载体转导法 Company Logo 转基因植物细胞的筛选与检测 负向筛选体系 负向筛选体系使植物产生抗性的机理是它对抗生素类，除草剂类或其它类似物具有解毒作用，使其变为解毒的抗生素的衍生物，从而使转基因的细胞对抗生素等不敏感，而未转基因的细胞对抗生素等敏感而被杀死。这些使用除草剂和抗生素作为选择性物质的筛选体系虽然目前应用的比较广泛，但是选择性标记基因与目的的基
