1、SI中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 5 1.5-2 0 0 3对 虾杆 状病毒(B P)检 测方法P r o t o c o l o f d e t e c t i o n f o r B a c u l o v i r u s p e n a e i2 0 0 3-0 5-2 8 发布2 0 0 3-1 2-0 1实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布S N/T 1 1 5 1.5-2 0 0 3前言本标准是采用 O I E的 水生动物健康手册 2 0 0 0 年版的检疫规程。本标准的附录 A是规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委
2、员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:江育林、陈莉莉、潘坤永、史秀杰。S N/T 1 1 51.5-2 0 0 3对 虾 杆 状 病 毒(,B P)检 测 方法范 围本标准规定了用直接显微镜镜检和用聚合酶链式反应(P C R)技术检测对虾杆状病毒的方法。本标准适用于对虾杆状病毒的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡
3、是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法(e q v I S O 3 6 9 6:1 9 8 7)G B/T 1 8 0 8 8-2 0 0。出人境动物检疫采样 S N/T 1 1 5 1.3-2 0 0 2 斑节对虾杆状病毒(MB V)诊断方法试 荆和材料1 阳性病毒D N A:由O I E参考实验室提供或由国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。2 水:应符合 G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2中一级水的规格。3 T a q 酶:-2 0 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4 d NT P:含d C T
4、 P,d G T P,d A T P,d T T P各 1 0 mmo l/L,5 引物:有二对引物可选用。使用时浓度为 4 0 Is mo l/L。其序列如下:B PI F:5 -GAT-C TG C AA-GAGGAC-AAA-C C-3 B P l R:5 -A T C-G C T-A A GC T C-T G GC AT-C C-3 扩增目的基因中的 5 6 0饰 片段。B P2 F:5 -TGT-TC T-CAG-CCA-ATA-CAT-C G 3 B P 2 R:5 -A T C-C T GT T T-C C A-A G C-T C T-G C-3 扩增目的基因中的5 8 0 b
5、y 片段。6 异丙醇:分析纯，使用前预冷到一2 0-C.7 矿物油:要求无DN A酶和R NA酶。8 D NA分子量标准(Ma r k e r),9 样品缓冲液:按使用说明书中规定的比例与样品混合。3段乳3.3.3.3.33.34器材和设备4.1 P C R扩增仪。4.2 电泳仪。4.3 微量移液器及吸头。4.4 紫外观察灯。4.5 恒温培养箱。4.6 普通冰箱和低温冰箱。4.7 电动匀浆器。4.8 普通显微境。4.9 离心机和离心管。4.1 0 剪刀、镊子。S N/T 1 1 5 1.5-2 0 0 35 直接光学显徽镜检查5.1 原理 取活的(鲜活的、濒死的或有损伤的)对虾的 肝胰腺，或者
6、用收集到的粪便样品做湿压片，观察B P在肝胰腺中形成的有特征性的三角形包涵体.52 新鲜组织湿片法 必须是活虾，取出肝胰腺。幼体在解剖镜下将肝胰腺摘出，置于载玻片上，小心地制备压片。用相差或亮视野显微镜检查，在 肝胰腺或中肠的湿压片中，如果观察到上皮细胞的核内 有单个或多 个四面 体的 包涵体，就可以诊断为B P 感染。包涵体呈四面体或金字塔形，从金字塔底部到顶部的尺寸为0.1 li m 2 0 u m 之间，大多数垂直的长度为8 K m-1 0 ft m。可与MB V的 球形包涵体明显区 分开来。可以按照 S N/T 1 1 5 1.3-2 0 0 2中的方法做组织切片后进行光镜镜检包涵体。
7、5.3 粪便检查 粪便检查可在不杀死对虾的情况下检查对虾是否带有 B P。该方法适用于稚虾或大一些的对虾，在用非致死方法检查有经济价值的亲虾时特别适用。把对虾放在水簇箱、产卵箱或其他合适的水箱中待数小时，直到水箱底部出现粪便。用塑料虹吸管吸取排泄物，放在玻璃离心管中。把粪便制成湿片，直接用显微镜检查包涵体。B P的包涵体是明显的带折射的四面体，高度在 0.1 fa m-2 0 p m之间。聚合酶链式反应(P C R)6 1 样品 用收集到的粪便样品、取活的对虾肝胰腺或保存在 9 5 环的乙醇中的对虾肝胰腺样品都可以用作P C R检测的模板。6.2 D N A抽提 在粪便或肝胰腺样品中加人消化缓
8、冲液(见附录 A)，样品和缓冲液的比例为 1:1 0.碾碎后，用木质牙签或微量吸管头把样品分散开来。样品在缓冲液里被分散后，6 0 加热 1h，然后 9 5 处理1 0 m i n.1 2 0 0 0 g 离心2 m i n，把上清液移到一个新的 微量管中，然后置于冰上保存。移取 8 0 0 p L消化后的样品，在含有样品的离心管中加人 6 0 0,L抽提液 1(见附录 A)，充分混匀3 0 s,1 2 0 0 0 r/m i n 离心5 m i n，取上层水相(约7 0 0 I L)。再加人6 5 0 L L 抽提液2(见附录A)，充分混匀3 0 s,1 2 0 0 0 r/mi n离心5
9、mi n，取上层水相(约6 0 0 u L)。再加人 1.5 倍体积的无水乙醇(约 9 0 0 F L),倒置数次混匀后，-2 0 0C,8 h以上以沉淀核酸。1 2 0 0 0 r/mi n 离心 3 0 s，弃去上清。干燥后加 1 0 V L无菌 蒸馏水溶解，用作P C R模板。6.3 P C R 用P C R 检测B P时，每个抽提样品要煮沸3 m i n，使D N A变性，然后放在冰水中 迅速 冷却。然后依次 加人以 下试剂:T a q 酶5 U,d N T P 2 y L，引物(B P I 或B P 2 都可以)各2.5 p L,1 0 倍用浓缩的T a q 酶缓冲 液(见附录A)1
10、 0 K L,2 5 m m o l/L的氯化镁(Mg C l )1 0 p L、加水到总体积为1 0 0 K L。每管加人5 0 p L 矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层，再将反应管置于P C R扩增仪。9 4 下处理反应混合物 3 m i n后，开始 3 0 个循环(核酸变性 9 4 C,1 mi n;引物退火 6 0 0C,1 mi n;延伸7 2 0 C 1 m i n)，然后7 2 下延伸5 m i n，最后4 保温。合成的P C R反应产物可通过2%琼脂糖电泳与标准分子量进行比较。6.4 设立对照 在 6.1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。取
11、已知含有 B P病毒的对虾肝胰腺组织或粪便作为阳性对照(可以是已知的病毒 D N A核酸)。取已知阴性的对虾肝胰腺组织或粪便作为阴性对照。取等体积的水代替模板作为空白对照。S N/T 1 1 51.5-2 0 0 36.5 琼脂铂电泳 用T B E电泳缓冲液(见附录A)配制2%的 琼脂糖(含。.5 p g/m L E B，见附录A)平板。将平板放人水平电 泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。按比例将样品和样品缓冲液混合点 样。在电泳时设立D N A 标准 分子量M a r k e r 作对照，推荐 使用p U C 1 9 D N A/M s p I(H p a II)。5 V/c m电泳约0.5
12、h,当澳酚蓝到达底部时停止，在紫外灯下观察核酸带.7 结果判定 P C R 后阳 性对照会出 现一条5 6 0 b y(当 用引物B P 1 时)或5 8 0 b y(当用引物B P 2 时)的D N A片 段.阴性对照和空白对照没有该核酸带。待测样品电泳后在相应位置上有带者为阳性。无带或带的大小不对的为阴性。用上述任何一种方法(如肝胰腺组织的湿片压片法或粪便条的湿片法或 P C R)都可以对 B P感染作出确诊。因为B P 在肝胰 腺中 形成的包涵体很明显并且形态也很特异性。用光镜直接观察新鲜样品，或镜检固定并按常规制备切片的样品都可以很容易看到它们.S N/T 1 1 5 1.5-2 0
13、0 3 附录A(规范性附录)试荆配制A.1 消化缓冲液 抓化钾(K C D Tr i s-HCI 明胶 N o n i d e t P-4 0 吐温-2 0 蛋 白酶 K5 0 mmo l/L1 0 mm o l/L p H 8.30.1 mg/mL0.4 5%0.4 5 0 a8 0 fa g/m LA.2 抽提液 酚/三氯甲烷/异戊醇:用 1 mo l/L T r i s 水溶液饱和的酚:三氯甲烷:异戊醇=2 5 2 4闭避光保存。混合，密A.3抽提液 2 三氯甲烷/异戊醇:将二者按 2 4:1 的比例混合，密闭避光保存。A.4 T B E电泳缓冲液(5 倍浓缩液)T r i s 5 4.0 g硼酸2 7.59EDTA 2.9 g用 5 mo l/L的盐酸(HC D调到 p H 8.0。加水到 1 0 0 0 mL oA.S E B(核酸染色剂)用水配制成 1 0 mg/mL的浓缩液。用时每 1 0 mL电泳液或琼脂中加 1 u L,A.6 T a q酶用 1 0 倍浓缩缓冲液Tr i s-HCI氯化钾(KC DTr i t o n X-1 0 05 0 0 mm o l/L p H 8.85 0 0 mmo l/L1%
