1、 1 ICS 65.150 B 52 DB51 四川省地方标准 DB51/T 24672018 鲫疱疹病毒 II 型病诊断技术规程 2018-04-18 发布 2018-05-01 实施四川省质量技术监督局 发 布 DB51/T 24672018 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 试剂和材料.2 5 设备和器械.2 6 临床检查.2 7 实验室样品采集.2 8 病毒的分离.2 9 病毒鉴定.3 10 综合判定.4 附录 A（规范性附录）试 剂 配 方.5 附录 B（资料性附录）CyHV-2 解旋酶基因参考序列（1446bp）.6 DB51/
2、T 24672018 II 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川农业大学。本标准起草人：耿毅、余泽辉、陈德芳、邓梦玲、黄小丽、欧阳萍、郑李平。DB51/T 24672018 1 鲫疱疹病毒 II 型病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鲫疱疹病毒II型病诊断的术语与定义、试剂和材料、临床检查、实验室样品采集、病毒分离、病毒鉴定和综合判定等技术规程。本标准适用于鲫（Carassius auratus）与金鱼疱疹病毒II型病的诊断。2
3、 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。3.1 鲫疱疹病毒 II 型 Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2 是一种感染鲫鱼及其变种（金鱼、异育银
4、鲫与彩鲫等）的高致病性病毒，又称金鱼造血器官坏死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus,GFHNV）或疱疹病毒性造血器官坏死病病毒（Herpesviral haematopoietic necrosis virus,HVHNV）。3.2 巢氏 PCR Nested Polymerase Chain Reaction 巢氏聚合酶链氏反应。3.3 CPE Cytopathic effect 细胞病变效应。3.4 GFF Goldenfish fin 金鱼鳍细胞系。DB51/T 24672018 2 4 试剂和材料 4.1 水 用水应符合 GB/T 668
5、2 中一级水的规格。4.2 试剂与培养基 按 GB/T 4789.28 与 SC/T 7014 规定执行，金鱼鳍细胞系（GFF）、小牛血清（FBS）、M199营养液、青霉素、链霉素。Taq酶、dNTPs、Mix-reaction buffer、DNA分子量标准参照物（1000bp DNA Maker）与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录A。4.3 巢氏 PCR 引物 DNA 解 旋 酶 基 因 巢 氏 PCR 扩 增 引 物 外，P1-F：5-TGAAATGTCAAAAGTGGATGG-3，P1-R：5-TATTCCCAGACAGCCTTCAAA-3，扩增片段大
6、小716bp；内引物，P2-F：5-GAACACCGCTGCTCATCATC-3，P2-R：5-ACTCTTCGCAAGTCCTCACC-3，扩增片段大小357bp。-20保存。5 设备和器械 主要设备与器械如下：解剖盘、剪刀、镊子和手术刀、组织匀浆器、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌锅、超净工作台、一次性滤器（0.22m）、普通冰箱、超低温冰箱、倒置显微镜、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、水平电泳系统、凝胶成像系统与CO2培养箱等。6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼离群独游，摄食减少或停止摄食，常在池塘边呈浮头状缓慢游动。6.2 外部检查 病鱼体表出血，尤其以口、鳃盖、眼球周围
7、、下颌、鳍条基部最为明显；部分病鱼腹部膨大，眼球突出。6.3 剖检 鳃明显充血、出血，呈现典型“大红鳃”，或腐烂坏死；肝、肾肿大、出血；脾肿大，发黑。部分病鱼鳃丝苍白，鳔壁瘀斑状出血。7 实验室样品采集 样品采集按 GB/T 18088 与 SC/T 7103 执行。8 病毒的分离 DB51/T 24672018 3 8.1 样品处理 应在10C以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆，再用细胞培养液PBS缓冲液(A.1)按1:10的最终稀释度组织悬液，加入100IU/mL双抗（青霉素、链霉素A.2）后，置4C冰箱作用1-2h后，反复冻融3次，用0.22m的一次性滤器过滤除菌，滤液保存于20或以下温
8、度冷冻保存。8.2 细胞接种与观察 将上述滤液用细胞培养液(A.3)再做两次10倍稀释，然后将这1:10、1:100、1:1000三种稀释度的滤液，分别接种到生长24-48h的GFF单层细胞，按每2cm2的细胞单层接种100L，的中，25C吸附1-2h后弃病毒液，然后加含2%FBS和100IU/ml双抗的M199细胞培养维持营养液(A.4)，置于25C培养。接种滤液后的细胞，7d内每天每天用倒置显微镜观察CPE出现情况。典型的CPE为细胞空泡、变圆、脱落。若细胞出现CPE，收集细胞液进行鉴定。若细胞在接毒后7d未出现CPE，盲传一次，再培养观察7d，未出现CPE的样品则可判定为阴性。9 病毒鉴
9、定 9.1 样品处理 对有临床症状的病鱼，按8.1的要求取样匀浆后取50mg-100mg于1.5ml EP管中；对出现CPE的细胞培养样品取450L于1.5ml EP管中。用CyHV-2核酸作为阳性对照，无感染CyHV-2鲫鱼正常组织或无病毒感染的细胞培养物为阴性对照，用等体积的双蒸水作为空白对照。9.2 DNA 提取 DNA提取可使用商品化的组织病毒DNA抽提试剂盒(按说明书操作)，或使用传统酚-氯仿提取法，具体操作如下（传统法）：a)将样品置于-40冰箱反复冻融 3 次，12000r5min。b)取上清 400l，加入 500ul tris-饱和酚，充分混合，静置 5min，12000r5
10、min，4。c)取上清加入饱和酚，氯仿各 200l，混匀，静置 5min，12000r5min，4。重复一次。d)取上清加入 200l 氯仿，混匀，12000r5min，4，此时将出现分层。如果中层蛋白多，则重复上一步骤。e)取上清加 1-2 倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置 20min，12000r5min，4。f)弃上清，用 75%酒精洗涤，12000r5min，4，重复操作一次。g)弃上清，操作台中自然晾干后，20-30lTE 溶解沉淀，-20保存，备用。9.3 巢氏 PCR 扩增反应 分两步进行，先使用外引物P1-F和P1-R进行PCR扩增，将获得的PCR产物为模板使用内引物P2-F
11、和P2-R进行二次扩增。9.3.1 第一次 PCR 扩增反应 反应体系：12.5L Mix-reaction buffer，P1-F和P1-R各 1L（10mol/L），DNA模板2L，无菌双蒸水补足体积至25L。混匀后，3000r/min离心30s。反应条件：94C预变性5min，94C变性30s，55C 退火30s，72C 延伸40s，循环30次，最后在72C延伸10min。DB51/T 24672018 4 9.3.2 第二次 PCR 扩增反应 反应体系：12.5L Mix-reaction buffer，P2-F和P2-R引物各 1L（10umol/L），取1L第一次PCR产物为模板，
12、无菌双蒸水补足体积至25L。混匀后，3000r/min离心30s。反应条件：同第一次PCR反应。9.4 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A.5）配制1的琼脂糖（A.6）平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液（A.7）刚好淹没胶面。将上述6L样品和2L溴酚蓝指示剂溶液（A.8）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120V电泳约20 min-40min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察。9.5 结果判定 第一次PCR后阳性对照出现一条716bp的DNA片段条带，阴性对照和空白对照没有该扩增条带。第二次PCR后阳性对照出现一条357bp的DNA片段条带，阴性对照和空白对照
13、没有该扩增条带。待测样品PCR扩增后能在相应的716bpDNA位置上有带，且巢氏PCR扩增后在相应357bp位置上有带者；或者虽经PCR扩增后可能因为浓度太低看不到可见的目的条带，但第二次PCR扩增后在相应357bp位置上有带者，均可判定为阳性，无带则为阴性。若第二次PCR扩增条带大小和阳性片段接近难以确定，则进行测序，并与已知序列（附录B）比对，同源性达98%以上则为阳性，否则为阴性。10 综合判定 有临床症状，满足以下任何一条都可以确诊为CyHV-2阳性，判定患鲫疱疹病毒II型病。细胞培养出现典型CPE，巢氏PCR检测阳性；直接提取病灶组织 DNA 作为模板，巢氏 PCR 检测阳性。若没有
14、临床症状，满足以下任何一条都可以确诊为 CyHV-2 阳性，判定为 CyHV-2 携带。细胞培养出现典型 CPE，巢氏 PCR 检测阳性；直接提取组织 DNA 作为模板，巢氏 PCR 检测阳性。DB51/T 24672018 5 A A 附 录 A（规范性附录）试 剂 配 方 A.1 PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)800 mL超纯水中溶解 8gNaCl，0.2g KCl，3.58g Na2HPO412H2O，0.24g KH2P04，用1mol/L HCl调节pH为7.4，加超纯水定容至1L，高压灭菌，室温保存备用。A.2 双抗 将青霉素和链霉素霉素用超纯水配成各为10,000I
15、U/mL浓度的混合储存液，经0.22m孔径的滤膜过滤后分装，-20C保存，使用时的工作浓度为100 IU/mL。A.3 M199 营养液 按说明书方法进行配制，按说明书加入一定量的NaHCO3调节营养液 pH值为7.2，定容至1L，0.22m滤器过滤除菌后分装，4C保存备用。A.4 细胞生长液（含 10%胎牛血清的M199）、细胞维持液（含 2%胎牛血清的M199）相应加入胎牛血清即可。A.5 TE缓冲液（pH8.0）将0.121g Tris碱（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水中，加浓盐酸调节pH至8.0，加双蒸水定容至100mL，室温
16、保存。A.6 1%琼脂糖凝胶 琼脂糖1g中加入1xTAE缓冲液100mL，加热溶解后，加入5L Goldenview混匀。A.7 50TAE电泳缓冲液 在400mL双蒸水中溶解121g Tris碱，加入28.55mL冰乙酸和50mL 0.5/L EDTA。再加双蒸水定容至500mL，室温保存。使用时，配成1TAE电泳缓冲液。A.8 溴酚蓝指示剂溶液 6上样缓冲液 将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。DB51/T 24672018 6 B B 附 录 B（资料性附录）CyHV-2 解旋酶基因参考序列（1446bp）1 ATGTGCAACG TGACGGCGAG TACTCTGAAC GCTGCCGGTA TACACGCTGA CTCGAGGACC 61 ATACACAGCT ACATGGGTTT CAACACGACC GAGCTGTTGG ATCTGAACGC TTCGGACGAG 121 ACGTGGTTCC TAGCCTACAA GGAGAGACAC AAGG
