1、 天津市奶业科技创新协会 发布 TB 团体标准团体标准 T/TDSTIA 0082019 巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶活性的测定 发光法 Determination of alkaline phosphatase activity in pasteurized milkEnzymatic photo-activated system method 2019-11-26 发布 2019-12-01 实施 全国团体标准信息平台 1 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由国家奶业科技创新联盟提出，适用于联盟内部实施优质乳工程的企业，其
2、他单位可参考。本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。本标准主要起草人：郑楠，张养东，文芳，王加启，刘慧敏，叶巧燕，屈雪寅，孟璐。请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。全国团体标准信息平台T/TDSTIA 008-2019 2 巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶活性的测定 发光法 1 范围 本标准规定了采用发光法测定碱性磷酸酶活性的方法。本标准适用于巴氏杀菌乳。本标准检出限为20 mU/L。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的
3、引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 碱性磷酸酶活性 alkaline phosphatase activity 特定条件下每分钟转化1 mol稳定芳香族底物所需的碱性磷酸酶的量，用mU/L表示。4 原理 在碱性磷酸酶的存在下，稳定的芳香族底物在351下水解，生成化学发光产物，大分子增强组分将光信号放大，在规定的孵育时间后，停止水解，在用已知酶活性片剂校准过的发光检测仪上，测量化学发光产物的量，并将其转换成碱性磷酸酶活性。5
4、 试剂或材料 除非另有规定，仅适用分析纯试剂。5.1 水，GB/T 6682，一级。5.2非化学发光二氧杂环丁烷酯底物（0.2 mol/L）：3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3-磷酸苯基）-1,2二氧杂环丁烷二钠盐，溶于含1荧光素的DEAE缓冲液。有商品化试剂可用如全国团体标准信息平台T/TDSTIA 008-2019 3 Charm AP液体1)。宜将底物储存于07之间；底物若在4、琥珀色塑料小瓶中储存，有效期6个月；若在30、琥珀色塑料小瓶中储存，只能稳定24 h。在测定中使用底物时，将其保持在07或置于冰上。5.3 终止液：称取1.337 g 2-氨基-2-甲基-1-丙醇（CA
5、S：124-68-5），用水溶解并定容至100 mL。称取0.02 g苯扎氯铵（CAS：63449-41-2），用水溶解并定容至100 mL。上述两种溶液各取50 mL，混匀，调节pH至10.7，作为终止二氧杂环丁烷酯底物的酶水解反应的终止液。使用前需将其恢复至室温（1824）。有商品化试剂可用如Charm AP液体2)。该溶液在4可稳定1年，在室温下有效期2个月。5.4 乙酸镁溶液：称取35.4 g四水合乙酸镁（CAS：142-72-3），溶于25 mL水中，可适当加热以助于溶解，待温度冷却至室温后，定容至100 mL。04储存，有效期1年。5.5 碱性磷酸酶校准片：由有已知碱性磷酸酶含量的
6、干燥生乳制成的片剂，碱性磷酸酶活性为875 U26 U，使用前用不含碱性磷酸酶的液体乳复原。市售碱性磷酸酶校准片在4下保存，有效期2年。有商品化试剂可用如Charm AP校准片3)。5.6 巴氏杀菌乳校准液：取3支50 mL试管分别标记为A1、B1和C1，在每个试管中用100 L水溶解一个校准片。分别向管A1中加入20 mL，管B1中加入5 mL，管C1中加入2.5 mL无磷酸酶活性的巴氏杀菌乳样品，使校准液A1、B1和C1的酶活性分别为44 mU/L、175 mU/L和350 mU/L。盖上盖子，剧烈振荡。冷藏条件下放置10 min。使用前混匀。5.6 阳性质控：使用碱性磷酸酶冻干粉制备阳性
7、质控，用 10 mL 不含磷酸酶活性的阴性试样复原，静置 10 min，制得含 450 mU/L 碱性磷酸酶的阳性质控，使用前剧烈振荡。复原的阳性质控在 07可保存 48 h,在-15以下可保存 2 个月。使用时于室温水浴中解冻，剧烈振荡使其均质。不宜反复冻融。6 仪器设备 6.1 化学发光检测仪：540 nm，配温度探针，通过内置软件将线性输出信号直接转换为酶活性（如Charm Luminometer型号NovaLum4)）或带化学发光检测功能的酶标仪。1)1商品化底物溶液 Charm AP液体可从 Charm Sciences Inc.获得。此处列出试剂品牌仅为提供参考，并不涉及商业目的。
8、如果使用其他品牌可以得出相同的结果，标准使用者可以使用等效产品。2)2终止液用于终止底物 AMPPD 的酶解反应。商品化终止液可从 Charm Sciences Inc.获得。此处列出试剂品牌仅为提供参考，并不涉及商业目的。如果使用其他品牌可以得出相同的结果，标准使用者可以使用等效产品。3)3商品化试剂 Charm AP校准片可从 Charm Sciences Inc.获得。此处列出试剂品牌仅为提供参考，并不涉及商业目的。如果使用其他品牌可以得出相同的结果，标准使用者可以使用等效产品。4)4商品化化学发光光度计可从 Charm Sciences Inc.获得。此处列出品牌仅为提供参考，并不涉及
9、商业目的。如果使用其他品牌可以得出相同的结果，标准使用者可以使用等效产品。全国团体标准信息平台T/TDSTIA 008-2019 4 6.2 天平：感量为1 mg，0.1 mg。6.3 移液器：100 L，1 mL，5 mL。6.4 孵育器：351，630.2。6.5 水浴锅：630.2，952 6.6 一次性带盖小管：由不发光塑料制成，2 mL。6.7 试管：50 mL，带防漏盖。6.8 96孔酶标板：白色、不透明。7 样品 7.1 总则 样品至少准备50 mL或50 g，测试前将样品混匀。测试时，样品应冷藏或在冰上进行测试，环境温度应在1824之间。由于唾液中含有碱性磷酸酶，测试过程中应避
10、免唾液的污染。7.2 试样制备 7.2.1 巴氏杀菌乳试样 巴氏杀菌乳试样冷藏（07），混匀。7.2.2 阴性试样 取适量试样在95水浴（6.5）加热保持1 min，然后快速冷却。对于一些乳制品，如羊乳，在95下保持1 min可能发生沉淀和分离，在这种情况下，可降低温度并延长时间。阴性试样若储存在07，可保存48 h；在-15的温度下储存，可保存6个月。经冷冻的阴性试样，需于室温水浴中解冻。使用前将剧烈振荡样品使其均匀，不宜反复冻融。用阴性试样校准光度检测仪零点，在适当校准的通道中，平均值应小于5 mU/L。8 试验步骤 8.1 校准 1（适用于带直接测定酶活性结果的内置软件的化学发光检测仪）
11、8.1.1 应对每类乳制品分别进行校准，建立各种待测类型产品的校准曲线。当换用新批次/批号的底物和终止液时，需重新进行校准。8.1.2 设定发光检测仪，默认背景值为 100，校准值为 100。全国团体标准信息平台T/TDSTIA 008-2019 5 8.1.3 用阴性用阴性试样校准试样校准：用移液器移取 100 L 底物（5.2）加入一次性带盖小管底部，再加入100 L 阴性试样，混匀，置于 35的孵育器中孵育 3 min。在孵育结束后的 15 s 内加入 1.0 mL 终止液（5.3）。从孵育器中取出小管，盖上盖子，并剧烈振荡 5 s。将小管插入发光检测仪（6.1），读取并记录检测仪的读数
12、。试验重复 3 次，计算平均阴性值（N），若任何一个值超过平均值的 30，则按 8.1.3 重新测定。8.1.4 用用 350 mU/L 校准校准液液校准校准：用移液器移取 100 L 底物（5.2）加入一次性带盖小管底部，再加入 100 L 校准品 C1或 C2，混匀，置于 35的孵育器中孵育 3 min。在孵育结束后的15 s 内加入 1.0 mL 终止液（5.3）。从孵育器中取出小管，盖上盖子，并剧烈振荡 5 s。将小管插入发光检测仪（6.1），读取并记录检测仪的读数。试验重复 3 次，计算平均校准值（Cx），若任何一个值超过平均值的 30，则按 8.1.4 重新测定。8.1.5 使用平
13、均校准值 Cx（8.1.4）和阴性平均值 N（8.1.3），按式（1）计算校正值 Cr，按式（2）计算背景值 Bg。参阅光度检测仪手册将校正值 Cr 输入检测仪中，建立新的校正值，背景值 Bg 输入光度计成为新的背景值。Cr=(Cx-N)0.286 （1）Bg=N/(Cr/100)+100 （2）8.1.6 再次用再次用阴性阴性试样校准试样校准：重复 8.1.3 的操作。验证无碱性磷酸酶巴氏杀菌乳和灭菌乳的平均值是否小于 5 mU/L，无碱性磷酸酶发酵乳、调制乳和奶油是否小于 15 mU/L。若平均值超出范围，从 8.1.3 开始重新测定。8.1.7 再次用再次用 350 mU/L 校准校准液
14、液校准校准：重复 8.1.4 的操作。验证校准品平均值是否在 320 mU/L400 mU/L 范围内。若任何一个值超过平均值的 30，从 8.1.4 开始重新测定。8.1.8 用用 44 mU/L 或或 88 mU/L 校准校准液液校准校准：参照 8.1.4 的操作，但将加入 100 L 校准品 C1或 C2更改为加入 100 L 校准品 A1或 A2，其余操作步骤同 8.1.4。验证 44 mU/L 的校准液平均值是否在 32 mU/L55 mU/L，或 88 mU/L 校准品平均值是否在 45 mU/L110 mU/L 范围内。若任何一个值超过其平均值的 40，则按 8.1.8 重新测定
15、。8.1.9 用用 175 mU/L 校准校准液液校准校准：参照 8.1.4 的操作，但将加入 100 L 校准液 C1或 C2更改为加入 100 L 校准品 B1或 B2。验证 175 mU/L 校准品平均值是否在 145 mU/L205 mU/L 范围内。若任何一个值超过平均值的 30，则按 8.1.9 重新测定。8.1.10 阴性质控检测阴性质控检测：按测定程序（8.1.3）进行，不加待测样品。每天进行阴性质控测试，以验证光度检测仪校准和试剂性能。在适当校准的通道，若测得的碱性磷酸酶活性水平低于5mU/L，则系统通过验证（阴性结果）。全国团体标准信息平台T/TDSTIA 008-2019
16、 6 8.1.11 阳阳性质控检测性质控检测：用阳性质控样品（5.6），参照 8.1.4 的操作，但将加入 100 L 校准品C1或 C2更改为加入 100 L 阳性质控样品（5.6）。每天进行阳性质控检测，以验证光度计校准和试剂性能。阳性质控样品（5.6）测定值应在 300 mU/L585 mU/L。若在此范围内，表明校准完成，可进行样品测定（8.3），且本次校准对于该批次底物和终止液有效；若超出范围，重新配制阳性质控样品，按 8.1.11 重新测定；若仍然超出范围，从 8.1.3 开始重新校准光度检测仪。8.2 校准 2（适用于具有化学发光检测功能的酶标仪）8.2.1 应对每类乳制品分别进行校准，建立各种待测类型产品的校准曲线。当换用新批次/批号的底物和终止液时，需重新进行校准。8.2.2 移取100 L底物（5.2）至一次性带盖小管底部，加入100 L校准液（碱性磷酸酶活性分别为0、44、175、350、450 mU/L）至小管底部，混匀，置于35的孵育器（6.4）中孵育3 min。孵育结束后，15 s内加入1.0 mL终止液（5.3）。从孵育器中取出小管，盖上盖子，并剧烈振荡5
