1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 17052021代替 SN/T 17052006国境口岸森林脑炎检验方法Examination method for tick-borne encephalitis at entry-exit port中华人民共和国海关总署发 布ICS 11.020CCS C 622021-06-18 发布2022-01-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准ISN/T17052021前 言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件代替 SN/T 17052006出入境口
2、岸森林脑炎检验规程。本文件与 SN/T 17052006 相比，主要技术变化如下：增加了 7.4“实时荧光 RT-PCR 检验”。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国长春海关。本文件主要起草人：杨怀宁、王玮琳、谢忠伟、丁旭、马文晨、杨迪、宋屿竹。本文件所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 17052006。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T17052021国境口岸森林脑炎检验方法1 范围本文件规定了出入境口岸森林脑炎检验规程，包括检验方法、结果报告、阳性结果处置。本文件适用于出入境口岸森林脑炎的实验室检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通
3、过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 森林脑炎 tick-borne encephalitis；TBE由黄病毒科黄病毒属中森林脑炎病毒经硬蜱叮咬所致自然疫源性急性中枢神经系统传染病，又称苏联春夏脑炎和远东脑炎。临床特征是突发高热、意识障碍、头痛、项强、上肢与颈部及肩胛肌瘫痪，后遗症多见。3.2 酶联免疫吸附法 enzy
4、melinked immunosorbent assay；ELISA将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。3.3 间接免疫荧光 indirect immunofluorescence直接免疫荧光技术的改进。待检细胞首先用未标记的抗体处理，使之与特异的抗原形成复合物，然后再用抗体的荧光标记抗体着色，即可检测出特异抗原在细胞中的存在部位，具有荧光增强效应。3.4 实时荧光定量 PCR quantitative real-time PCRreal-time RCR 是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。
5、由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。4 生物安全实验室生物安全应符合 GB 19489（所有部分）中的规定。PCR 防污染措施按照 WS/T 230 确定的以正式出版文本为准2SN/T17052021要求进行。5 仪器设备5.1 含 FAM、HEX、Tecas Red、CY5 四种荧光检测通道的实时荧光 PCR 仪。5.2 生物安全柜。5.3 普通冰箱。5.4 70 超低温冰箱。5.5 普通台式离心机。5.6 荧光显微镜。5.7 酶联免疫测定仪。5.8 微量移液器（10 L、100 L、200 L、1 000 L）及配套带滤芯吸
6、头。5.9 离心管（1.5 mL、2 mL）。6 样本处理6.1 血液样本血液样本采集后，用生物安全箱在冷藏的条件下迅速送往实验室，当日分离血清。6.2 蜱样本采集的蜱先冰冻，然后将每个蜱分别置于 5%的 Chelex100 树脂溶液中（每个若虫置于 200 L 溶液中，每个成虫置于 500 L 溶液中）。每次在一个试管中用锋利的手术刀片切一个蜱，蜱的成虫切成4 块6 块，若虫切成 2 块4 块，此过程要在液面以下进行，手术刀片在切下一只蜱之前要用火焰消毒。含有样品的试管经涡轮振荡后于 56 孵育过夜，随后将样品在 98 100 孵育 15 min，涡轮振荡 10 s，冰浴并离心，取上清作检验
7、。7 实验室检验方法7.1 间接免疫荧光检验将处理后样本按商品化试剂盒的说明书操作，下面以商品化试剂盒 TBE 抗体（IgG，IgM）间接免疫荧光法检测试剂盒为例：a）将加样板放在操作台上，按顺序分别滴加 25 L 稀释后血清至加样板的每一反应区，避免产生气泡。加完所有待测标本后再开始温育（最多 200 份）;b）将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一样品均在生物薄片接触且样品间互不接触。室温（18 25）温育 30 min;c）用烧杯盛 PBS 吐温缓冲液流水冲洗载片 1 s，然后立即将其进入装有 PBS 吐温缓冲液的洗杯中浸泡至少 5 min。有条件的情况
8、下可用旋转摇床进行振荡;d）滴加 20 L FITC 标记的抗人 IgG 或 IgM（荧光二抗）至洁净加样板的反应区，完全加完所有的荧光二抗方可进行下一步温育。建议使用连续加样器。FITC 标记的抗人 IgG 或 IgM 使用前需混匀。为节约时间，可在第一次温育的同时滴加二抗至另一个加样板的反应区;e）从洗杯中取出一张载片，5 s 内用吸水纸擦去背面和边缘的水分后，立即盖在加样板的凹槽内；注：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。确保生物薄片与液滴接触良好，然后继续下一张。室温 以正式出版文本为准3SN/T17052021（18 25）温育 30 min，注意避免阳光直射载片。f）用烧杯盛 P
9、BS 吐温缓冲液流水冲洗载片 1 s，然后立即将其进入装有 PBS 吐温缓冲液的洗杯中浸洗至少 5 min。有条件的情况下可用旋转摇床进行振荡。可在每 150 mLPBS 吐温缓冲液中加 10 滴伊文斯蓝作为衬染；g）将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加甘油-PBS 至盖玻片；每一反应区约 10 L。从PBS 吐温缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和边缘的水分，注意不要擦拭反应区间隙。将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入载片的凹槽里；h）显微镜下观察荧光模型：1）阳性对照模型：抗 TBE 病毒抗体在感染细胞的细胞浆中表现特异性荧光模型，而细胞核为阴
10、性。成群的感染细胞根据其感染程度不同，荧光模型表现为清晰的粗滴状到网状结构，部分未感染的细胞没有荧光；2）如果血清中存在抗 TBE 病毒抗体，其荧光模型与阳性对照模型相同；3）如果所有细胞的细胞核或细胞浆被染色，可能存在抗核抗体或抗线粒体抗体及其他的细胞抗原；4）如果阳性对照没有出现特异性的荧光模型或阴性对照出现清楚的特异性荧光模型，则说明实验结果不可靠，实验应重做。7.2ELISA 检验将处理后的样本，按商品化试剂盒的说明书操作，下面以商品化试剂盒抗 TBE 抗体（IgG，IgM）ELISA 检测试剂盒为例：a）将待测标本用样品缓冲液 1101 稀释。例如：取 10 L 血清用 1 mL 样
11、品缓冲液稀释并充分混匀。检验特异性的 IgM 抗体前，应除去病人血清中的 IgG 型的抗体，可以用超速离心、层析或免疫吸附的方法进行；b）向相应微孔分别加标准血清，阳性对照，阴性对照和稀释后血清各 100 L，室温（18 25）温育 30 min；c）倒掉微孔板内液体，用稀释后的清洗缓冲液洗三次，每次 300 L。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留 30 s，然后再倒掉。清洗后，应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液；d）滴加 100 L 酶结合物至每一微孔，室温（18 25）温育 30 min；e）倒掉微孔板内液体，如上述步骤清洗；f）滴加 100 L 色原/底物液至每一微孔，室温（
12、18 25）温育 15 min；g）以与加色原/底物液时相同的速度和顺序滴加 100 L 终止液至每一微孔；h）450 nm 比色，参考波长 620 nm650 nm，加完终止液后 30 min 之内比色。比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀；i）半定量公式：比值=对照或血清标本的吸光度值/标准品的吸光度值。比值 0.8 为阴性，0.8 比值 1.1 为可疑阳性，比值 1.1 为阳性。对于可疑阳性标本，建议 7 d 后重新取样并与第一次实验标本平行进行检验，方可正确评价抗体滴度变化。7.3RT-PCR 检验7.3.1 Trizol 试剂提取总 RNA7.3.1.1 将蜱媒样品放置于干净的平皿
13、中，用手术刀片将蜱媒样品切碎，放入 1.5 mL 离心管中，加入300 L Trizol裂解液，用研磨仪进行研磨，简短离心，取上清液，待检测。或将血液样品进行离心，以正式出版文本为准4SN/T170520213500 r/min 离心 5 min，取血清，待检测。7.3.1.2 取 1.5 mL 离心管，加入 600 L Trizol 裂解液，取 200 L 蜱上清液/血清，再加入 200 L 三氯甲烷上下颠倒混匀，于 4、12 000 r/min 离心 15 min。7.3.1.3 吸取上清液转入新 1.5 mL 离心管中，加入 500 L 异丙醇（-20 预冷），不要吸入中间层，颠倒均匀。
14、7.3.1.4 于 4、12 000 r/min 离心 15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入 600 L 75%的乙醇，颠倒洗涤。7.3.1.5 12 000 r/min 离心 10 min，小心倒去上清液，4 000 r/min 离心 10 s，将管壁上残余的液体甩到管底部，用微量加样器吸干（吸头不要碰有沉淀的一面），室温干燥。7.3.1.6 加入 20 L RNAase free H2O，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心 5 s，4 保存备用。提取的 RNA 应在 2 h 内扩增，若长期保存应放置-70 冰箱。7.3.2 逆转录反应（RT
15、）7.3.2.1 在总 RNA 沉淀中加入：Oligo（dT）0.05 g/mL 1 LRNAase free H2O 9 L混合后置 65 水浴 10 min，冰浴 2 min。7.3.2.2 向上述溶液中加入下列试剂：5 逆转录酶缓冲液 4.0 LdNTPs（10 mmol/L）4.0 LRNasin（40 U/mL）0.25 L逆转录酶（200 U/L）0.5 LRNAase free H2O 11.25 L混合后置 37 水浴 1 h。7.3.2.3 将上述反应液移入 68 水浴 10 min（灭活逆转录酶）或直接-20 保存备用。7.3.3 聚合酶链式反应（PCR）7.3.3.1 下
16、列一对引物根据森林脑炎病毒（TBEV）基因的一段设计，具有高度特异性，可作使用时参考。阳性标本可扩增出 175 bp 的片段：上游引物：5-GCGTTTGCT（C,T）CGGA-3；下游引物：5-CTCTTTCGACACTCGTCGAGG-3。7.3.3.2 取 PCR 管编号，参考一下加样量加样：模板 1 L10PCR 缓冲液（含氯化镁）5 L4 dNTPs（10 mmol/L）2 L上游引物（10 mol/L）1 L下游引物（10 mol/L）1 LTaqDNA 聚合酶（2 U/L）0.5 LRNAase free H2O 39.5 L充分混匀后，在离心机上将管内液体甩入管底。进行 PCR 扩增，反应条件：94 5 min，然后94 30 s，55 30 s，72 1 min，35 个循环，最后 72 5 min。7.3.3.3 扩增结束后在管中加入上样缓冲液，在 1.5%琼脂糖凝胶（含 0.5 g/mL 溴化乙锭）中电泳，紫外灯下观察结果。7.3.3.4 如阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带（扩以正式出版文本为准5SN/T17052021增片
