1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4624.182021入境环保用微生物菌剂检测方法第 18 部分：短短芽孢杆菌Test method of import microbe agentia in the environment protection-Part 18:Brevibacillus brevisr2021-06-18 发布2022-01-01 实施ICS 11.020CCS C 62中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 4624.182021I前 言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化
2、文件的结构和起草规则的规定起草。本文件为 SN/T 4624入境环保用微生物菌剂检测方法的第 18 部分。SN/T 4624 已经发布了以下部分：第 1 部分：地衣芽孢杆菌第 2 部分：短小芽孢杆菌第 3 部分：巨大芽孢杆菌第 4 部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌第 5 部分：型溶血性链球菌第 6 部分：金黄色葡萄球菌第 7 部分：沙门氏菌第 8 部分：志贺氏菌第 9 部分：致泻大肠埃希氏菌第 10 部分：淡紫拟青霉第 11 部分：雅致小克银汉霉第 12 部分：哈茨木霉第 13 部分：黄孢原毛平革菌第 14 部分：焦曲霉第 15 部分：解淀粉芽孢杆菌第 16 部分：类产碱假单胞菌第 17 部分：恶臭假
3、单胞菌第 18 部分：短短芽孢杆菌第 19 部分：红串红球菌第 20 部分：泛养副球菌本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国沈阳海关、二连浩特国际旅行卫生保健中心。本部分主要起草人：王金玲、张莹、杨喜凤、罗力涵、李大力。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 4624.182021入境环保用微生物菌剂检测方法 第 18 部分 短短芽孢杆菌1 范围本文件规定了入境环保用微生物菌剂短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）的形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光 PCR 检测方法。本文件适用于入境环保用微生物菌剂短短芽孢杆菌检测和鉴定。2 规范性引用
4、文件下列文件中的内容通过文件的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义4 短短芽孢杆菌分类地位学名：Brevibacillus brevis。分类地位：芽孢杆菌科（Bacillaceae），短芽孢杆菌属（Brevibacillus）。5 方法原理分离纯化菌株后，进行形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光 PCR 检测，根据菌的形态特征结果、生化鉴定结果、实时荧光 PCR 特异性片段扩增结果，3 项
5、结果都符合时判断该菌是否为目标菌株。6 仪器设备6.1 电子天平（感量 0.01 g）。6.2 恒温培养箱：30 1、50 1。6.3 恒温振荡培养箱：30 1。6.4 恒温水浴锅。6.5 台式冷冻离心机（最高转速 15 000 r/min）。6.6 PCR 扩增仪。6.7 生物显微镜：10100。以正式出版文本为准2SN/T 4624.1820216.8 厌氧培养装置：30 1。6.9 微量移液器和灭菌吸头：10 L、20 L、200 L、1 000 L。6.10 高压灭菌锅。6.11 PCR 超净工作台。6.12 电泳仪。6.13 核酸/蛋白分析仪。6.14 凝胶成像系统。6.15 无菌培
6、养皿：直径 90 mm。7 主要试剂和培养基7.1 实验用水（应符合 GB/T 6682 中一级水的规格）。7.2 营养琼脂：按附录 A 中 A.1 配制。7.3 营养肉汤：按附录 A 中 A.2 配制。7.4 革兰氏染色法相关试剂：按附录 A 中 A.3 配制。7.5 芽孢染色法相关试剂：按附录 A 中 A.4 配制。7.6 接触酶：按附录 A 中 A.5 配制。7.7 氧化酶：按附录 A 中 A.6 配制。7.8 糖发酵管（葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇）：按附录 A 中 A.7 配制。7.9 硝酸盐还原：按附录 A 中 A.8 配制。7.10 7%NaCl 生长：按附录 A 中 A.
7、9 配制。7.11 淀粉水解：按附录 A 中 A.10 配制。7.12 明胶：按附录 A 中 A.11 配制。7.13 TE 缓冲液（pH 值 8.0）：按附录 A 中 A.12 配制。7.14 1%3%琼脂糖凝胶：按附录 A 中 A.13 配制。7.15 25 mM EDTA：按附录 A 中 A.14 配制。7.16 3 M 醋酸钠：按附录 A 中 A.15 配制。7.17 dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP 配制。7.18 TBE：按附录 A 中 A.16 配制。7.19 Taq DNA 聚合酶。7.20 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。7.21 琼脂糖。7.22 溴化乙锭。
8、7.23 DNA 分子量标记：100 bp DNA l adder。8 样品制备、培养8.1 以无菌操作取 1 g（mL）样品加入到 100 mL 生理盐水中混匀，移取 1 环菌连续划线接种 5 个营养琼脂平板，30 1 培养 18 h24 h。取样过程中，在样品旁边放置 1 个营养琼脂平板作为空白对照。8.2 挑取平板上 35 个菌落平坦、光滑，色泽白色，生长后期一般黄灰色的菌落进行形态学鉴定。8.3 挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养，30 1 条件下培养 18 h24 h；再从纯培养平板上挑取菌落接种营养肉汤，30 1 条件下 180 r/min 振荡培养 18 h24 h。以
9、正式出版文本为准3SN/T 4624.1820219 形态学鉴定9.1 培养性状短短芽孢杆菌在营养琼脂上的菌落平坦、光滑，色泽白色，生长后期一般黄灰色。9.2 形态特征革兰氏染色及芽孢染色：将 8.2 中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，将该平板在冰箱中放置48 h 待形成芽孢后，进行芽孢染色，镜检。短短芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，菌体宽度 1.2 m1.5 m，长度 2.0 m5.0 m，内生孢子，芽孢不膨大，不形成伴胞晶体。10 生化鉴定也可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等。取 8.3 中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每个生化管加入 100 L 增菌肉汤。短短芽孢杆菌生化
10、特征见表 1。表 1 短短芽孢杆菌生化特征鉴定项目短短芽孢杆菌接触酶+氧化酶+/-厌氧生长+葡萄糖+木糖-L-阿拉伯糖-甘露醇+硝酸盐还原+50 生长+pH 值 5.7 生长-7%NaCl 生长+淀粉水解-明胶液化+11 分子生物学检测11.1 细菌模板 DNA 的提取11.1.1 直接提取法取 8.3 中菌液 1 mL 加到 1.5 mL 无菌离心管中，10 000 r/min 离心 2 min，尽量弃净上清液（如果以正式出版文本为准4SN/T 4624.182021肉眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作）。沉淀加入 TE 100 L、10 mg/mL 溶菌酶 100 L，37 温育
11、30 min，12 000 r/min 离心 2 min，沉淀加入 TE 缓冲液 600 L 重悬，再加入 15 mg/mL 蛋白酶 25 L，55 温育 1 h 后沸水浴 10 min，12 000 r/min 离心 5 min，取上清液保存于-20 保存以待检测。11.1.2 有机溶剂提取法取 8.3 中菌液 1 mL 加到 1.5 mL 无菌离心管中，10 000 r/min 离心 2 min，尽量弃净上清液（如果肉眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作）。沉淀加入 TE 缓冲液 570 L 重悬，然后加入 10 mg/mL 溶菌酶 100 L，37 温育 30 min，再加入 10
12、%SDS 30 L，65 温育 10 min，加入等体积的酚混匀，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清液加等体积的酚氯仿（11，体积比）混匀，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，沉淀用 500 L75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇浑发，加入 100 L 无菌水（预先加热至 65 有利于 DNA 溶解），-20 保存以待检测。11.1.3 试剂盒法使用
13、商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。11.1.4 DNA 质量检测用核酸/蛋白分析仪分别在 260 nm 和 280 nm 下测定 OD 值，用于实时荧光 PCR 反应的 DNA 纯度一般为 1.6 OD260/OD280 2.0。DNA 纯度=OD260/OD280DNA 浓度（mg/mL）=50OD26011.2 实时荧光 PCR 鉴定11.2.1 引物和探针序列引物和探针序列见表 2。其中探针的 5 端标记 FAM，3 端标记 TAMRA。表 2引物和探针序列鉴定菌名称引物序列探针序列短短芽孢杆菌cell wall protein precursor,ge
14、ne GenBank AF424046.15-GCGCCGCAACTTTTGATT-35FAM-CTCAGGCGTTTAATAGG-TAMRA35-CACAATTCCCCGTTTTTCGT-311.2.2 实时荧光 PCR 反应体系实时荧光 PCR 反应体系见表 3。表 3实时荧光 PCR 反应体系试剂名称实时荧光 PCR 反应体系2.5Real Master Mix12.5 L正向引物（10 pmol/L）1 L以正式出版文本为准5SN/T 4624.182021表 3（续）试剂名称实时荧光 PCR 反应体系反向引物(10 pmol/L)1 L探针(5 pmol/L)1 LDNA 模板2 L
15、（约 50 ng200 ng）50ROX Reference Dye*3 0.25 LddH2O补充至 25 L注 1：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。注 2：50ROX Reference Dye*3 荧光试剂仅在具有 ROX 校正通道的实时荧光 PCR 仪上进行扩增添加，否则 用超纯水补足。注 3：检测样品设置两个平行反应。11.2.3 实时荧光 PCR 反应参数实时荧光 PCR 反应参数见表 4。表 4 实时荧光 PCR 反应参数循环步骤温度/时间内容119415 min起始模板变性402943 sPCR 循环中模板变性35932 s退火延伸注 1：使用
16、不同实时荧光 PCR 仪，可对参数作适当调整。注 2：设置实时荧光 PCR 反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪 器使用说明书。11.2.4 实验对照的设立11.2.4.1 阴性对照：非短短芽孢杆菌 DNA 为模板。11.2.4.2 阳性对照：已知短短芽孢杆菌的 DNA 或含有待测基因序列的质粒为模板（参见附录 B）。11.2.4.3 空白对照：设两个，一是提取 DNA 时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光 PCR 反应的空白对照（以水代替 DNA 模板）。11.2.5 实时荧光 PCR 扩增结果判定11.2.5.1 对照结果11.2.5.1.1 阴性对照：无扩增曲线。11.2.5.1.2 阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct 值应 30.0。11.2.5.1.3 空白对照：无扩增曲线。11.2.5.1.4 否则，检测视为无效。11.2.5.2 结果判定11.2.5.2.1 Ct 值大于等于 40.0，可判定该样品实时荧光 PCR 结果为阴性。11.2.5.2.2 Ct 值小于等于 35.0，可判定该样品实时荧光 PCR 结果为阳性
