1、54卷南 方 农 业 学 报 704基于转录组测序分析枸杞多糖对免疫抑制雏鸡脾脏基因表达的影响王建东1，唐玉林2，王敏3，张宝锁4，杨富强4，高海慧1，于洋1，郭延生2*（1宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川750002；2宁夏大学农学院，宁夏银川750021；3宁夏银川市妇幼保健院，宁夏银川750001；4宁夏顺宝现代农业股份有限公司，宁夏吴忠751600）摘要：【目的】利用转录组测序技术分析枸杞多糖（LBP）对免疫抑制雏鸡脾脏基因表达的影响，挖掘LBP修复雏鸡免疫抑制的靶基因，为探究枸杞多糖对雏鸡免疫抑制的修复机制提供理论依据。【方法】将120羽7日龄海兰褐蛋鸡随机分成空白组（NC）、
2、环磷酰胺（CTX）组（CY）和LBP组（CYLbGp），NC组肌注生理盐水，其余2组连续3 d肌注80 mg/（kgd）CTX造模，造模后通过测定血清中IL-2、IL-6和INF-含量对免疫抑制雏鸡模型进行验证。造模成功后在CYLbGp组饮水中加入5 mg/（kgd）LBP，给药结束后采集脾脏进行转录组测序，以P0.05和|log2Fold change|1为条件筛选出差异表达基因（DEGs），并进行GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析，以探究枸杞多糖对免疫抑制的修复作用。【结果】共获得1049301886个Raw reads，对其进行质控、过滤后，共获得1032097278个Clean
3、 reads。CY组和NC组之间共有701个DEGs，CYLbGp组和CY组之间共有748个DEGs。GO功能注释显示，LBP干预后显著回调的DEGs主要与结合、细胞过程、生物调节及细胞组分等功能相关。KEGG信号通路富集结果显示，LBP干预后显著回调的DEGs主要与神经活性配体-受体相互作用和视黄醇代谢通路相关，筛选出所富集的通路中关键的DEGs为人毒蕈碱型胆碱受体M5基因（CHRM5）、烟碱型乙酰胆碱受体4基因（CHRNB4）、代谢型型谷氨酸受体1基因（GRM1）、胆囊收缩素基因（CCK）、神经肽Y1受体基因（NPY1R）、细胞色素P450家族成员2C18基因（CYP2C18）、血管紧张素
4、受体1基因（AGTR1）、细胞色素P450家族成员3A5基因（CYP3A5）、丝氨酸蛋白酶2（PRSS2）和神经紧张素基因（NTS）。RT-qPCR结果与转录组学数据变化趋势基本一致，表明转录组数据有较高的可靠性。【结论】LBP修复雏鸡免疫抑制的作用机制可能与调节神经活性配体-受体相互作用和视黄醇代谢通路有关，其中CHRM5、CHRNB4、GRM1、CCK、NPY1R、CYP2C18、AGTR1、CYP3A5、PRSS2和NTS可作为LBP修复雏鸡免疫抑制的靶基因。关键词：枸杞多糖；雏鸡；环磷酰胺；转录组学中图分类号：S858.3；S852.4文献标志码：A文章编号：2095-1191（202
5、3）03-0704-11收稿日期：2022-11-27基金项目：宁夏自然科学重点基金项目（2020AAC02032）通讯作者：郭延生（1978-），https:/orcid.org/0000-0002-9882-0706，副教授，主要从事中兽药临床应用研究工作，E-mail：guoyan-第一作者：王建东（1980-），https:/orcid.org/0000-0002-9207-5100，副研究员，主要从事动物疾病防治研究工作，E-mail：jiandong-南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（3）：704-714ISSN 2095-1
6、191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.006Effects of Lycium barbarum polysaccharide on genes expressionin spleen of immunosuppressed chicks based on transcriptomesequencingWANG Jian-dong1，TANG Yu-lin2，WANG Min3，ZHANG Bao-suo4，YANG Fu-qiang4，GAO Hai-hui1，YU Yang1，GUO Yan-sheng2*（1
7、Institute ofAnimal Science，NingxiaAcademy ofAgriculture and Forestry Sciences，Yinchuan，Ningxia 750002，China；2College ofAgriculture，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750021，China；3Maternal and Child Health Care Hospi-tal of Ningxia，Yinchuan，Ningxia 750001，China；4Ningxia Shunbao ModernAgriculture Co
8、.，Ltd.，Wuzhong，Ningxia 751600，China）Abstract：【Objective】This paper analyzed the effects of Lycium barbarum polysaccharide（LBP）on the gene expres-sion of spleen of immunosuppressed chicks via transcriptome sequencing，and explored the target genes of repair mecha-3期7050引言【研究意义】免疫抑制是由于动物机体的免疫器官、组织和细胞在疾
9、病、饲料霉菌毒素、药物、营养失衡和应激等一种或多种不良因素作用下出现暂时性或永久性免疫应答功能不全的状态。当机体处于免疫抑制的状态时，外界病原微生物更易入侵机体，且疫苗接种的效果也会降低，从而增加鸡群继发感染和免疫缺陷的发生，这在很大程度上影响了鸡群的健康生长（史若男等，2014）。近年来，随着养鸡业的发展不断趋于集约化和规模化，鸡群出现免疫抑制的情况也越来越多，严重制约了养鸡业的发展。在当前饲料禁抗的背景下，寻找到一种低残留、无毒副作用的中草药提取物调节鸡群的免疫状态，已成为当前兽医从业人员的研究热点。枸杞（Lycium bar-barum）在我国已有2500多年的食、药用历史，是一种药食同
10、源中药在传统中药学中其具有滋肝补肾、益精明目之功效（王莎莎等，2018）。现代大量药理研究表明，枸杞具有很强的免疫调节活性，而枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是其发挥增强免疫力功效的主要活性成分之一（葛影影等，2021；王亚妮等，2022）。经证实，LBP具有抗氧化应激（Yao et al.，2018）、抑菌消炎（Gan et al.，2018）、保护神经（Gao et al.，2018）、降血糖血脂（Masci et al.，2018）、增强免疫（Zhou et al.，2020）等功能。因此，基于转录组学技术研究枸杞多糖对免疫抑制雏鸡脾脏的
11、基因表达的影响，对枸杞多糖对雏鸡免疫抑制的修复机制具有重要的研究意义。【前人研究进展】目前大量研究表明，植物多糖可通过多种方式和多个水平调节免疫系统。Su等（2014）研究发现，LBP可通过诱导Tfh细胞的产生，进而调节B淋巴细胞成熟和体液免疫功能。Zhao等（2017）研究表明，桔梗多糖可显著促进淋巴细胞增殖，提高CD4+和CD8+T细胞水平，进而提高机体免疫功能。孙晓雨等（2015）研究发现，LBP能显著改善环磷酰胺免疫抑制小鼠脾脏T和B淋巴细胞亚群比例。体外培养树突状细胞时添加LBP可上调细胞表面CD80、CD86和MHC II类分子表达水平（董晓筱，2020；陈艳平等，2021）。王思
12、月（2019）研究表明，LBP能显著改善肉鸡肠道菌群结构，提高血液中IgA和IgG水平，并增加IL-2和IL-6基因的表达水平，从而达到增强免疫的作用。崔小珍等（2020）研究发现，添加不同浓度的松针多糖后，提高体外培养的鸡巨噬细胞HD11活力和一氧化氮（NO）分泌量的水平，进而促进巨噬细胞的吞噬能力。Fan等（2020）使用脂多糖构建黄羽肉鸡免疫应激模型后，再通过饲喂添加蘑菇多糖的日粮，蘑菇多糖可显著降低血浆细胞因子INF-和TNF-水平，提高免疫球蛋白IgG和IgM水平，进而增强黄羽肉鸡的免疫能力。Long等（2020）研究发现，在肉鸡日粮中添加LBP能显著提高生长性能，增强机体抗氧化应激
13、能力，并增加血清中IgG、IgA、IL-4、IL-6、TNF-和IFN-水平。上述研究表明，植物多糖不仅nism of LBP on immunosuppression of chicks.【Method】A total of 120 7-day-old Hy-Line brown laying hens were ran-domly divided into negative control group（NC），cyclophosphamide（CTX）group（CY）and LBP group（CYLbGp）.TheNC group was intramuscularly injecte
14、d with normal saline，while the other two groups were intramuscularly injected with80 mg/（kgd）CTX for 3 consecutive days for modeling.After modeling，the immunosuppressed chick model was veri-fied by measuring the levels of IL-2，IL-6 and INF-in serum.After successful modeling，the CYLbGp group drinking
15、water was added 5 mg/（kgd）LBP，after the administration of CYLbGp group，spleen was collected to be used fortranscriptome sequencing，diferentially expressed genes（DEGs）ofP90%），连续30 d。在CYLbGp组给药结束后第1 d，3个组均随机选取6只鸡，取脾脏于冻存管中，-80 超低温冰箱保存。1.2免疫抑制模型验证造模结束后，从NC组、CY组和CYLbGp组中各随机挑选出5只雏鸡进行心脏采血，收集血清后使用ELISA法测定血清
16、中IL-2、IL-6和IFN-水平（IL-2、IL-6和IFN-检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司），通过检测血清中细胞因子水平，验证免疫抑制模型雏鸡是否建立成功。采用SPSS 22.0单因素方差分析中最小显著差异（LSD）法处理试验数据，用平均值标准差表示，并进行差异显著性分析。1.3转录组测序采用TRIzol试剂法从雏鸡脾脏组织样品中提取总RNA，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计对所提取的总RNA浓度和纯度进行检测，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，再使用Agilent 2100生物分析仪测定RNA完整值（RIN）。利用带有Oligo（dT）的磁珠与ploy（A）进行A-T碱基配对，从总RNA中分离出mRNA，用于分析转录组信息，再加入Fragmen-tation Buffer，将mRNA随机断裂，通过磁珠筛选分离出300 bp左右的小片段。加入六碱基随机引物（Ran-dom hexamers），在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板反转录合成一链cDNA，随后进行二链合成，形成稳定的双链结构，从而完成整个cDNA文库的制备，并在Illumina NovaSeq 6
