1、2023(15):90-97,138饲草、饲料与添加剂 收稿日期:2022-07-05;修回日期:2023-05-19基金项目:山东省牛产业技术体系项目(SDAIT-09-07);山东省农业重大技术协同推广计划项目“引入专门化肉牛品种育繁推一体化关键技术集成与示范(SDNYXTTG-2023-07)”;潍坊市科技发展计划项目(2021GX028)作者简介:柳美玲(1982),女,讲师,硕士,研究方向为动物微生物及牛羊疾病防控,lml533 .通信作者:胡士林(1962),男,教授,硕士,研究方向为牛羊疾病防控,sdmxhsl .DOI:10.13881/ki.hljxmsy.2022.07.0
2、047 基于宏基因组学分析单纯玉米秸秆饲喂对肉牛瘤胃微生物群落和 CAZy 的影响 柳美玲1,王云洲1,王爱华2,胡士林1,单 虎3(1.山东畜牧兽医职业学院,山东 潍坊 261061;2.山东邦基集团有限公司,山东 青岛 266100;3.青岛农业大学 动物医学院,山东 青岛 266109)中图分类号:S816.5;Q78 文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2023)15-0090-09摘 要:为了解玉米秸秆对肉牛瘤胃微生物群落和碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZy)的影响,试验随机选取 3 头健康、年龄和体重相近的西门塔尔杂交肉牛,
3、在试验开始的第 1 天采集瘤胃液(1 组,样品分别标记为 swqym1、swqym2、swqym3),然后连续单纯饲喂玉米秸秆 3 个月,在试验的最后 1 天再次采集瘤胃液(2 组,样品分别标记为 swhym1、swhym2、swhym3),利用宏基因组技术分析两组样品瘤胃液中微生物群落和 CAZy 的变化,在属水平上对物种丰度进行 PCA 分析,分别选取两组相对丰度排名前 10 位的门水平和种水平物种进行分析,对组间差异物种及 CAZy 功能进行Metastat 分析。结果表明:1 组和 2 组样品均能独自聚类,且两组样品之间的距离较远;2 组黏胶球菌门(Lentisphaerae)和浮霉菌
4、门(Planctomycetes)、梭菌(s_Clostridiales bacterium)的相对丰度显著高于1 组(P0.05),粪芽孢菌亚种 CAG:826(s_Coprobacillus sp.CAG:826)的相对丰度显著低于 1 组(P0.05);梭菌科嗜碱菌属(f_Clostridiaceae_g_Alkaliphilus)相对丰度极显著高于 1 组(Q0.01)。与1 组相比,2 组 UDP-3-O-酰基 N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(EC 3.5.1.-)、花青素 3-O-葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.115)、花青素 3-O-半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.-)的相对丰
5、度显著增加(Q0.05),-l-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)的相对丰度极显著下降(P0.01),内切木糖半乳糖醛酸水解酶(EC 3.2.1-)、外切聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)、外切多聚半乳糖甘酶(EC 3.2.1.82)、多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、鼠李糖半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.171)、d-4,5-不饱和-葡萄糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.-)、-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、内切-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)的相对丰度显著下降(P3 nmol/L)进行准确定量,确保文库质量13-14。2.2.3 上机测序文库检测合格后
6、,将不同文库按照有效浓度和目标下机数据量的需求进行混合(pooling),使用测序仪测序,此过程由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。2.3 信息分析获得的原始数据(raw data)存在一定比例低质量数据,为保证后续分析结果准确可靠,对测序得到的原始序列、有效序列、测序错误率小于 0.01(Q20)和 0.001(Q30)、GC 含量及有效率进行分析,获取用于后续分析的有效数据(clean data)。对样品质控后的 clean data 进行宏基因组(metagenome)组装,将各样品中未被利用上的碱基序列(reads)放在一起进行混合组装,以发现样品中的低丰度物种信息。使用 SOAP d
7、enovo(Version 2.21)组装软件进行组装分析13,15-17。采 用 基 因 预 测 软 件 MetaGeneMark(Version 2.10)18进行基因预测,获得基因目录(gene catalogue)在各样品中的丰度信息。将 gene catalogue 与 MicroNR 数据库进行比对,获得每个基因(unigene)的物种注释信息,并结合基因丰度表获得不同分类层级的物种丰度表和 CAZy 的功能注释及丰度;基于物种丰度信息,利用 R 语言绘制花瓣图(各样品之间比较)和韦恩图(1 组与 2 组之间比较)。利用各个分类层级的物种丰度表进行 PCA 分析及 CAZy 功能相
8、对丰度聚类热图分析。2.4 组间差异物种及 CAZy 功能的 Metastat 分析利用 Metastat 方法19对组间的门水平和属水平物种,以及 CAZy 功能相对丰度进行假设检验得到 P值,通过对 P 值的校正得到 Q 值;根据 Q 值筛选具有显著性差异的物种和 CAZy 功能,并绘制差异物种和 CAZy 功能在组间的相对丰度分布箱图。Q0.01表示差异极显著,Q0.05 表示差异显著。2.5 数据的统计分析利用 SPSS 20.0 软件进行独立样本 t 检验,分析门水平和种水平排名前 10 位的微生物群落的相对丰度变化情况,试验结果以“平均值标准误”表示,P0.05 表示差异不显著,P
9、0.01 表示差异极显著。3 结果与分析3.1 宏基因组测序结果见表 2。表 2 宏基因组测序统计结果Table 2 Metagenomic sequencing statistical results组别样品名称原始序列/Mb有效序列/MbQ20/%Q30/%GC 含量/%有效率/%Swqym110 784.8610 773.4997.9894.0749.2099.8951Swqym210 641.6210 616.7397.8393.8748.4299.766Swqym39 807.309 788.9897.9494.0950.2299.816Swhym110 609.8610 596.6
10、897.9093.9551.4899.8762Swhym211 481.9311 478.7597.5992.8749.0799.885Swhym310 238.0910 178.7598.0694.3753.7099.420 由表 2 可知,有效序列中 Q20 和 Q30 分别在97.00%和 92.00%以上,说明测序数据可靠性较高。经去冗余后,基因预测共得到 1 278 270 条开放阅读框(ORFs)用于后续分析。3.2 基因数目差异分析绘制的花瓣图和韦恩图见图 1。由图 1 可 知,各 样 品 之 间 的 核 心 基 因 数 为154 768 个,两组之间共有基因数为 711 258
11、 个,2 组基因总数比 1 组(饲喂玉米秸秆之前)有所下降。3.3 饲喂前后瘤胃微生物群落组成变化分别选取 1 组和 2 组相对丰度排名在前 10 位的门水平和种水平物种进行分析,结果见表 3、表 4。由表 3 可知:1 组相对丰度排名前 10 位的门水平物种分别为拟杆菌门、厚壁菌门、纤维杆菌门、黏胶球菌门、螺旋体门、变形菌门、广古菌门、壶菌门、浮霉菌门及疣微菌门,其中拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌门。与 1 组相比,2 组的厚壁菌门、纤维杆菌门、黏胶球菌门、变形菌门、浮霉菌门及疣微菌门的相对丰度增加,其中黏胶球菌门和浮霉菌门的相对丰度显著增加(P0.05)。由表 4 可知:1 组相对丰度排名前
12、10 位的菌种分别为普雷沃氏菌亚种 tc2-28、梭菌、栖瘤胃普雷沃氏菌、普雷沃氏菌亚种 ne3005、拟杆菌 WCE2004、普雷沃氏菌亚种 tf2-5、拟杆菌 WCE2008、毛螺旋菌G41、类芽孢菌亚种 CAG:826 及短普雷沃氏菌。与1 组相比,2 组的梭菌、拟杆菌 WCE2004、拟杆菌WCE2008、毛螺旋菌 G41、短普雷沃氏菌的相对丰度增加,其中梭菌的相对丰度显著增加(P0.05);普雷沃氏菌亚种 tc2-28、栖瘤胃普雷沃氏菌、普雷沃氏菌亚种 ne3005、普雷沃氏菌亚种 tf2-5 及粪芽孢菌亚种CAG:826 的相对丰度下降,其中粪芽孢菌亚种 CAG:292023(15
13、):90-97,138饲草、饲料与添加剂注:当样本(组)数超过 5 个时,展示花瓣图;当样本(组)数小于 5 时,展示韦恩图。图 1 花瓣图和韦恩图Fig.1 Petal graph and Venn graph826 的相对丰度显著降低(P0.05)。表 3 门水平排名前 10 位物种的相对丰度Table 3 Relative abundance of the top 10 species at Phylum level门水平物种1 组2 组拟杆菌门(Bacteroiidetes)57.031.0250.601.75厚壁菌门(Firmicutes)15.015.7919.323.60纤维杆菌
14、门(Fibrobacteres)0.990.032.480.68黏胶球菌门(Lentisphaerae)0.53b0.001.00a0.03螺旋体门(Spirochaetes)0.560.460.250.05变形菌门(Proteobacteria)0.620.070.640.15广古菌门(Euryarchaeota)0.290.250.110.05壶菌门(Chytridiomycota)0.170.230.040.02浮霉菌门(Planctomycetes)0.20b0.120.33a0.03疣微菌门(Verrucomicrobia)0.230.040.260.06 注:同行数据肩标小写字母不
15、同表示差异显著(P 0.05)。3.4玉米秸秆对瘤胃微生物群落组成影响的 PCA分析在属水平上对物种丰度进行 PCA 分析,结果见图 2。由图 2 可知,在饲喂前后,1 组样品(swqym1、swqym2、swqym3)和 2 组 样 品(swhym1、swhym2、swhym3)均能独自聚类,而 1 组和 2 组样品之间的距离较远,说明 1 组和 2 组间瘤胃微生物群落结构存在明显差异,在单纯饲喂玉米秸秆后,对瘤胃菌群产生了影响。3.5 组间差异物种的 Metastat 分析利用 Metastat 方法对 1 组与 2 组进行组间物种的差异显著性分析,绘制出差异物种在组间的分布箱图,结果(见
16、图 3)显示,2 组梭菌科嗜碱菌属(f_Clostridiaceae_g_Alkaliphilus)相对丰度极显著高于 1组(Q0.01)。表 4 种水平排名前 10 位物种的相对丰度Table 4 Relative abundance of the top 10 species at Species level种水平物种1 组2 组普雷沃氏菌亚种 tc2-28(s_Prevotella sp.tc2-28)2.211.021.020.43梭菌(s_Clostridiales bacterium)1.04b0.603.72a1.43栖瘤胃普雷沃氏菌(s_Prevotella ruminicola)2.801.362.290.38普雷沃氏菌亚种 ne3005(s_Prevotella sp.ne3005)2.601.182.340.28拟杆菌 WCE2004(s_Bacteroidales bacterium WCE2004)2.160.242.900.50普雷沃氏菌亚种 tf2-5(s_Prevotella sp.tf2-5)1.751.001.110.50拟杆菌 WCE2008(s_
