1、第三节第三节 细菌的生化鉴定技术细菌的生化鉴定技术 细菌的基本鉴定技术 生化反应鉴定：通过观察细菌利用酶和降解糖类、醇类、脂类、蛋白质和氨基酸的能力可以了解其生化活性，从而识别和鉴定细菌。免疫学鉴定（血清学鉴定）编码鉴定 第一第一 碳水化合物代谢试验碳水化合物代谢试验 一、糖（醇、苷）类发酵试验：原理：各种细菌含有发酵不同不同糖类的酶酶，分糖类的能力各不相同，且不同细菌分解同一种糖的代谢产物也不一定相同。糖发酵试验结果判断糖发酵试验结果判断 反应现象反应现象 结果描述结果描述 酸性酸性变色变色、有气泡、有气泡 分解分解糖产酸、产气糖产酸、产气 酸性酸性变色变色、无气泡、无气泡 分解分解糖产酸、
2、不产糖产酸、不产气气 培养基不变色培养基不变色 不分解不分解糖糖 1原理：细菌在分解葡萄糖的代谢过程中根据对氧分子参加的需要，分成三种类型：需要分子氧参加的为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型，发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖。在有氧和厌氧环境中都不能分解葡萄糖的细菌为产碱型或不活动型细菌。二葡萄糖的氧化二葡萄糖的氧化/发酵试验：发酵试验：2结果：发酵特征试管颜色不变而氧化特征试管颜色变黄，表明试验细菌的葡萄糖分解代谢为氧化型；两管颜色均变黄色为发酵型；两支培养管颜色均不变为产碱型或不活动型。O管管 F管管 O管管 F管管 糖发酵试验 原理：细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸
3、，丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等，使培养pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈现红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质(如醇、酮、醛、气体和水)，培养基pH在5.4以上，甲基红(MR)试验呈橘黄色。三甲基红试验：三甲基红试验：2结果：呈现红色者为阳性；橘黄色为阴性；橘红色为弱阳性。MR阴性阴性 MR阳性阳性 某些细菌分解葡萄糖后生成丙酮酸，丙酮酸的分解产物则因细菌种类不同而有差别，如产气肠杆菌能使丙酮酸脱羧产生中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰，在-奈酚的催化作用下与培养基中氨基酸如精氨酸中的胍基化合物络合形成红色的化
4、合物，即V-P试验阳性。四四V-P试验：试验：VP阴性阴性 VP阳性阳性 五五半乳糖苷酶试验半乳糖苷酶试验(ONPG试验试验)：迟缓分解乳糖的细菌可产生半乳糖苷酶，能分解邻硝基酚-半乳糖苷(ONPG)而释放出黄色的邻硝基酚。故此试验又称为ONPG试验。细菌分解乳糖 需二种酶 半乳糖苷渗透酶 半乳糖苷 六六七叶苷水解试验：七叶苷水解试验：1原理：七叶苷可被细菌水解，生成葡萄糖和七叶素。七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应生成黑色的化合物，使培养基变黑。2结果：培养基变为黑色或棕黑色者为阳性，不变色者为阴性。第二第二 蛋白质和氨基酸代谢试验蛋白质和氨基酸代谢试验 有些细菌具有色氨酸酶，能分解
5、培养基中的色氨酸，生成吲哚。吲哚与试剂对位二甲氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。一吲哚试验一吲哚试验(靛基质试验靛基质试验)I阴性阴性 I阳性阳性 二二尿素酶试验：尿素酶试验：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生氨，使培养基变碱，使酚红指示剂变红色。U阳性阳性 U阴性阴性 四四苯丙氨酸脱氨酶试验：苯丙氨酸脱氨酶试验：细菌分解氨基酸，可通过脱氨基或羧基生成反应物，这些反应由酶反应进行的，试验应选择合适底物。有些细菌能产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸氧化脱氨后生成苯丙酮酸，与三氯化铁试剂产生深绿色反应。苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验 阴性阴性 阳性阳性 第三第三 碳源利用试验碳源利用试验 枸
6、橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验 C阴性阴性 C阳性阳性 在枸橼酸盐培养基中，细菌能利用的碳源只有枸橼酸盐，分解后生成碳酸钠，使培养基变碱性，pH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变为深蓝色。能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌也可利用氮源。第四第四 呼吸酶类试验呼吸酶类试验 硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验 硝酸盐还原反应包括两个过程：即细菌在合成代谢过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，由氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合物；细菌在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。硝酸盐还原的过程可因细菌不同而产物各异，有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐；有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有
7、的细菌还能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮；有的细菌还可以将其还原产物在合成代谢中完全利用。硝酸盐或亚硝酸盐如果还原生成气体的终末产物，如氮和氧化氮，称为脱硝化作用。硝酸盐还原试验是测定还原过程硝酸盐还原试验是测定还原过程中生成的亚硝酸。中生成的亚硝酸。硝硝酸酸盐盐还还原原试试验验 阴性阴性 阳性阳性 氧化酶试验【原理】氧化酶又称细胞色素氧化酶，能将还原型细胞色素C氧化形成水和氧化型细胞色素C，氧化型细胞色素C再使四甲基对苯二胺氧化，形成显色反应。氧化酶试验【试剂与器材】1菌种 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 2试剂 氧化酶试剂（1%四甲基对苯二胺）3器材 2cm2cm滤纸片、污物缸 氧化酶试验【操作步骤
8、】1将滤纸片叠成四方块状。2用滤纸片的中心尖角小心刮取大肠埃希菌菌落，注意不可碰到培养基。3轻轻展开滤纸片，刮取的菌落正好在滤纸片中心，滴加一滴1%四甲基对苯二胺。4立刻观察菌落颜色的变化。5同法做铜绿假单胞菌的氧化酶试验。氧化酶试验【结果】滴加氧化酶试剂后铜绿假单胞菌立刻变为紫色，为氧化酶阳性。大肠埃希菌不变色，为氧化酶阴性。氧化酶试验（左侧为铜绿假单胞菌、右侧为大肠埃希菌）氧化酶试验【注意事项】1实验中的菌种要求新培养的，不宜用陈旧的培养物。2刮取细菌时不可碰到培养基，不可用接种环等金属物品取菌。3氧化酶试剂要新鲜配制，一般装在棕色瓶中，放在冰箱中可保存一周，时间长了易被空气氧化变色。4结
9、果要立刻观察，1min内变色者为阳性，超过1min变色的为阴性。5在滤纸片上滴加试剂时不要过多，以刚润湿纸片为宜，如滤纸片过湿，可能妨碍空气与细菌接触，延长反应时间，造成假阴性。过氧化氢酶试验【原理】过氧化氢酶试验又称触酶试验。部分细菌含有黄素蛋白，在代谢过程中与空气中的氧发生反应，形成过氧化氢，过氧化氢对细菌有毒害作用，会破坏细胞组分，因此，细菌为保护自己，通常具有过氧化氢酶，可以催化裂解过氧化氢，形成水和氧气。过氧化氢酶试验【试剂与器材】1、菌种 金黄色葡萄球菌 2、试剂 3%过氧化氢 3、器材 载玻片、无菌移液器吸头、酒精灯、火柴、超净工作台 过氧化氢酶试验【操作步骤】1、在载玻片中央滴
10、加一滴3%过氧化氢。2、用无菌移液器吸头蘸取少量细菌，在3%过氧化氢中混匀。【结果】观察气泡的产生情况。可以看见在吸头上金黄色葡萄球菌菌苔周围，产生大量气泡，为过氧化氢酶阳性。如果菌苔周围无气泡产生，为过氧化氢酶阴性。过氧化氢酶试验【注意事项】1、普通金属接种环可能与过氧化氢反应，形成气泡，造成假阳性，因此必须使用铂丝接种环或塑料、玻璃材质的工具。2、从血液琼脂平板上挑取菌落时千万小心，不要碰到培养基，因红细胞中有过氧化氢酶，即使一点点也会造成假阳性。3、过氧化氢试剂现配现用。第五第五 复合生化试验复合生化试验 一一KIA试验：试验：成分成分：KIA主要用糖是葡萄糖与乳糖，比例为1：10，指示
11、剂为酚红。内还含有蛋白质4种衍生物：牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨和胨，硫代硫酸钠，铁盐等，无抑制物。KIA 连续培养数小时后，在细菌和氧的作用下，培养基斜面部分所含氨基酸发生降解，释放胺类，产即中和斜面部分酸，经1824小时后，整个斜面转变为碱性，又复原以红色。原理原理：如某菌只分解葡萄糖，不能分解乳糖，它分解葡萄糖产少量酸，在最初培育的812小时内，这少量的酸也足以使深层和斜面酚红指示剂变黄。如某菌既分解葡萄糖，又分解乳糖，那在KIA上产生大量酸（因乳糖含量多），超过斜面上形成的碱，成长整管培养基呈黄色。培养基深层的氨基酸降解作用不足以中和细菌分解葡萄糖所产生的少量酸，故深层仍呈黄色。培养基中
12、的硫代硫酸钠可供给细菌产生H2S所需要的硫，铁盐-硫酸亚铁和枸橼酸铵铁分别与H2S起反应，产生不溶性的黑色FeS沉淀。由于细菌产生H2S需要在酸性环境中，所以KIA只限于琼脂深层变黑。结果：碱性（K），酸性（A）K/K：不发酵碳水化合物，为不发酵：不发酵碳水化合物，为不发酵菌特征。菌特征。K/A：葡萄糖发酵，乳糖不发酵，如：葡萄糖发酵，乳糖不发酵，如志贺菌。志贺菌。K/A（黑色）：葡萄糖发酵，乳糖不（黑色）：葡萄糖发酵，乳糖不发酵并产生硫化氢，如沙门菌。发酵并产生硫化氢，如沙门菌。A/A：葡萄糖和乳糖发酵，如大肠埃：葡萄糖和乳糖发酵，如大肠埃希菌和克雷伯菌属。希菌和克雷伯菌属。二动力靛基质尿素
13、试验（二动力靛基质尿素试验（MIU）成分成分：MIU主要含尿素的半固体培养基，指示剂为酚红，内还有蛋白胨，蛋白胨中含有色氨酸。MIU 原理原理：当细菌在内生长，通过半固体培养基可观察其动动力力，另如果细菌能产生色氨酸酶，它可水解色氨酸形成靛基质，当加入对-二甲氨基苯甲醛（靛基质试剂）时可形成玫瑰色吲哚，玫瑰色吲哚为红色。如该菌又能产生尿素酶利用培养基中的尿素产碱，加酚红指示剂后显桃红色。因此MIU可以观察细菌动力、靛基质的产生和细菌分解尿素的活性。有动力有动力 无动力无动力 A管：管：MIU B管：管：MIU 明胶水解实验明胶水解实验 某些细菌能分泌明胶酶分解明胶，产某些细菌能分泌明胶酶分解明
14、胶，产生小分子物质。如果细菌具有分解明生小分子物质。如果细菌具有分解明胶的能力，则平板培养基中的明胶被胶的能力，则平板培养基中的明胶被分解成小分子的物质，在平板上加上分解成小分子的物质，在平板上加上蛋白凝固剂后，明胶被分解部分的培蛋白凝固剂后，明胶被分解部分的培养基呈现透明的状态，可以使菌落周养基呈现透明的状态，可以使菌落周围出现透明圈。围出现透明圈。淀粉水解实验淀粉水解实验 有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色不再变蓝色,在平板上加上碘液后，有在平板上加上碘液后，有淀粉的部分培养基遇淀粉变为兰色淀粉的部分培养基遇淀粉变为兰色,淀淀粉被分解部分的培养基呈现透明的状态，粉被分解部分的培养基呈现透明的状态，可以使菌落周围出现透明圈。可以使菌落周围出现透明圈。硫化氢产生实验硫化氢产生实验 某些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢遇重金属盐如铅盐、铁盐时则生成黑色硫化铅或硫化铁沉淀，从而可确定硫化氢的产生。在培养基中加入柠檬酸铁铵,培养后观察是否有黑色沉淀产生。培养基中加入硫代硫酸钠是为了保持低的氧化还原电位,防止产生的硫化氢被空气中的氧氧化,采用固体穿刺接种也是为了更好的保持低的氧化还原电位.
