1、第五章第五章 细菌检验技术细菌检验技术 第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术 一、细菌染色标本镜检 （一）染色标本检查的基本程序 1、涂片 2、干燥 3、固定 4、染色 染料种类：碱性染料、酸性染料、中性染 料，碱性染料最常用 （1）单染法 用一种染料进行染色，可观察细菌的大小、形态和排列，但不能用于鉴别细菌。如：亚甲蓝染色法（2）复染法 用两种或两种以上的染料进行染色，不仅可以观察细菌的大小、形态和排列。还可用于鉴别细菌，又称为鉴别染色。鉴别染色革兰染色 抗酸染色 复染法的一般步骤 初染媒染脱色复染 5、镜检 显微镜：光学显微镜 所用放大倍数：101001000 所用镜头：油镜头
2、镜油：香柏油或石蜡油 香柏油折光率（n1.515）与玻片折光率（n1.52）接近 显微镜使用完毕须擦拭镜头。（二）革兰染色法 1、染液组成：结晶紫染液、卢戈碘液、95乙醇、稀释复红 2、染色方法染色方法 标本涂片，固定 结晶紫初染（1分钟）碘液媒染（1分钟）95%乙醇脱色（30秒）复红复染（3-5分钟）3、染色结果 兰阳性菌（G+）紫色；革兰阴性菌 (G-)红色。4、染色原理（1）渗透学说：与肽聚糖结构有关 G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量
3、高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，复红复染后呈红色。（2）化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关 （3）等电点学说：与细菌所带电荷有关 5、临床意义 鉴别细菌 选择用药 理解细菌的致病作用 6、影响因素 （1）操作因素 涂片的厚薄 脱色时间的长短 （2）染液因素 卢戈碘液放置时间过长 95乙醇挥发 结晶紫与草酸铵混合时间太长 （3）细菌因素：细菌种类、细菌菌龄（三）抗酸染色法 用于鉴别抗酸杆菌和非抗酸杆菌 步骤：1、苯酚复红加温染色 2、盐酸酒精脱色 3、亚甲蓝复染 结果：抗酸杆菌为红色 非抗酸杆菌为蓝色（四）其他染色法 1、特殊结构染色法 2、负染色法 3、荧光染色
4、二、细菌不染色标本镜检二、细菌不染色标本镜检 应用：主要用于观察活菌的动力和运动方应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式式 常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法法 压滴法 载玻片载玻片 细菌悬液细菌悬液 盖玻片盖玻片 悬滴法 镜检镜检 3、暗视野聚光法、暗视野聚光法 4、相差显微镜检查法、相差显微镜检查法（二）影响因素（二）影响因素 1、操作因素、操作因素 2、玻片因素、玻片因素 3、光线强度、光线强度 第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术 一、基本条件一、基本条件（一）接种环与接种针（一）接种环与接种针 用于取菌、接种及分离细菌的器具用于取
5、菌、接种及分离细菌的器具 1、接种针用于挑去单个菌落、穿刺接种及、接种针用于挑去单个菌落、穿刺接种及斜面接种斜面接种 2、接种环用于划线分离培养、纯种接种、接种环用于划线分离培养、纯种接种、挑取菌落和菌液以及制备细菌涂片。挑取菌落和菌液以及制备细菌涂片。3、接种前后都应对接种环和接种针进行灭菌、接种前后都应对接种环和接种针进行灭菌（二）红外接种环灭菌器（二）红外接种环灭菌器 利用红外线产热进行灭菌利用红外线产热进行灭菌（三）培养皿（三）培养皿 制备固体培养基常用的器皿，用于细菌的制备固体培养基常用的器皿，用于细菌的分离培养。分离培养。附：微生物检验常用玻璃仪器的准备附：微生物检验常用玻璃仪器的
6、准备 1、玻璃器材的种类及用途、玻璃器材的种类及用途 2、玻璃器皿灭菌前的准备、玻璃器皿灭菌前的准备 玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。裹和加塞后才能进行灭菌处理。3、玻璃器材的清洗、玻璃器材的清洗 新购置的玻璃器材：新购置的玻璃器材：12盐酸浸泡盐酸浸泡清水清水清洗清洗 用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷清水清洗清水清洗 细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷 盛培养基试管和平皿：高压灭菌盛培养基试管和平皿：高压灭菌趁热倒出趁热倒出洗涤剂洗刷洗涤剂洗刷清水冲洗清水冲洗 吸管：吸管
7、：3来苏浸泡来苏浸泡清水冲洗清水冲洗 玻片和盖玻片：玻片和盖玻片：3来苏和清洁液浸泡来苏和清洁液浸泡清水清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗再洗涤涤 含油脂的器皿：单独灭菌含油脂的器皿：单独灭菌（四）培养箱（四）培养箱 1、电热恒温培养箱、电热恒温培养箱 2、二氧化碳培养箱、二氧化碳培养箱 3、厌氧培养箱、厌氧培养箱（五）培养基（五）培养基 培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。殖的综合营养基质。1、培养基的成分及作用、培养基的成分及作用 营养物质：肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血营养物质：肉浸液、牛肉
8、膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐 水水 凝固剂：琼脂、明胶凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂抑制剂 指示剂指示剂 2、培养基的种类、培养基的种类（1）按培养基的物理性状分类）按培养基的物理性状分类 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。种纯种细菌。半固体培养基：含半固体培养基：含0.30.5琼脂，用于琼脂，用于观察细菌的动力。观察细菌的动力。固体培养基：含固体培养基：含22.5琼脂，多用于琼脂，多用于细菌的分离培养。细菌的分离培养。（2）按培养基的用途分类）按培养基的用途分类 基础培养基：培养营养要求不
9、高的细菌，基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板如普通平板 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板生长，如血平板 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（鉴别细菌，如克氏双糖培养基（KIA）选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如选择性的培养目的菌，如SS平板平板 增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。厌氧培养基：用于培养厌氧菌厌
10、氧培养基：用于培养厌氧菌 3、培养基制备的一般程序 调配调配 溶化溶化 矫正矫正pH 过滤澄清过滤澄清 分装分装 灭菌灭菌 检定检定 培养基灭菌培养基灭菌 基础培养基：基础培养基：121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌15分钟分钟 含糖培养基：含糖培养基：113 灭菌灭菌15分钟分钟 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天天3次次 不耐高温的液体成分：滤过除菌不耐高温的液体成分：滤过除菌 保存保存 二、细菌接种与培养技术二、细菌接种与培养技术（一）无菌技术（一）无菌技术 1、细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台、细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。内进行。2、无菌室、超净工作
11、台使用前后需进行消毒。、无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。3、细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌、细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌 4、无菌试管、烧瓶、吸管的使用、无菌试管、烧瓶、吸管的使用 5、标本的采集、标本的采集 6、废弃物的处理、废弃物的处理 8、个人防护、个人防护（二）细菌接种与分离技术（二）细菌接种与分离技术 1、细菌接种的基本程序、细菌接种的基本程序 灭菌接种环灭菌接种环 沾取标本沾取标本 接种接种 灭菌接种环灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境 2、细菌接
12、种法、细菌接种法（1）平板划线接种法：）平板划线接种法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。单个菌落，以便获得纯菌。方法：方法：1）分区划线法：适用于含菌量较多的标本）分区划线法：适用于含菌量较多的标本 2）连续划线法：适用于含菌量较少的标本）连续划线法：适用于含菌量较少的标本 分区划线法 第一区划线第一区划线 灭菌接种环灭菌接种环 第二区划线第二区划线 灭菌接种环灭菌接种环 第三区划线第三区划线 灭菌接种环灭菌接种环 连续划线法 （2）液体培养基接种法）液体培养基接种法（3）穿刺接种法）穿刺接种法:用于观察细菌动力用于观察细菌动
13、力（4）斜面接种法）斜面接种法 （5）倾注培养法）倾注培养法:用于细菌计数用于细菌计数（6）涂布接种法：见于药敏试验）涂布接种法：见于药敏试验 （三）细菌的培养方法（三）细菌的培养方法 一般培养（需氧培养）：一般培养（需氧培养）：培养温度：培养温度：35（采用恒温培养箱）（采用恒温培养箱）培养时间：培养时间：1824h 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱、化学法箱、化学法 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等 三、细菌的生长现象三、细菌的生长现象（一）细菌在液
14、体培养基中的生长现象（一）细菌在液体培养基中的生长现象 混浊混浊 沉淀：多见于链状排列的细菌沉淀：多见于链状排列的细菌 菌膜：多见于厌氧菌菌膜：多见于厌氧菌 细菌在液体培养基中的生长现象细菌在液体培养基中的生长现象（二）细菌在半固体培养基中的生长现象（二）细菌在半固体培养基中的生长现象 有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。缘清晰。细菌在半固体培养基中的生长现象细菌在半固体培养基中的生长现象 有动力有动力 现象现象 无动力无动力
15、现象现象（三）细菌在固体培养基中的生长现象（三）细菌在固体培养基中的生长现象 菌落菌落 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性明度、湿润度、黏度、溶血性 菌落类型：光滑型（菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（）、粗糙型（R）、黏液型）、黏液型（M）菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌 落 菌落与菌苔 第三节第三节 细菌生化鉴定技术细菌生化鉴
16、定技术 细菌的生化反应：细菌具有各自独特的酶系细菌的生化反应：细菌具有各自独特的酶系统，因而在代谢过程中对底物的分解能力不统，因而在代谢过程中对底物的分解能力不同，所产生的代谢产物也不同，这些代谢产同，所产生的代谢产物也不同，这些代谢产物各具有不同的生物化学特点，利用生物化物各具有不同的生物化学特点，利用生物化学的方法来检验这些代谢产物，可用于鉴别学的方法来检验这些代谢产物，可用于鉴别和鉴定细菌，这种用生化反应测定方法称为和鉴定细菌，这种用生化反应测定方法称为细菌的生化反应。细菌的生化反应。一、碳水化合物的代谢试验 糖发酵试验糖发酵试验 葡萄糖氧化发酵试验（葡萄糖氧化发酵试验（O/F试验）试验）甲基红试验甲基红试验 V-P试验试验 七叶苷水解试验七叶苷水解试验 半乳糖苷渗透酶试验半乳糖苷渗透酶试验（一）糖发酵试验 原理：不同细菌可分解不同的糖原理：不同细菌可分解不同的糖 多糖多糖单糖单糖丙酮酸丙酮酸酸性产物酸性产物(或产酸产气或产酸产气)pH 指示剂呈酸性指示剂呈酸性变色变色(若产气者有气泡出现若产气者有气泡出现)培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微量发
