1、 DBS22 吉林省地方标准 DBS22/0272014 食品安全地方标准 食品中肠球菌的定性定量检验 2014-07-30 发布 2014-08-30 实施吉林省卫生和计划生育委员会 发 布 DBS22/0272014 1 吉林省食品安全地方标准 食品中肠球菌的定性定量检验 1 范围 本标准规定了食品中肠球菌（Enterococcus）的检验方法。本标准适用于食品中肠球菌的定性定量检验。2 术语和定义 肠球菌（Enterococcus）一类革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，无芽胞和荚膜，可分解胆汁七叶苷。是评估食品、水、食品加工设备、食品生产环境等卫生状况的指标菌之一。3 设备与材料 除微生物实验室
2、常规灭菌与培养设备外，其他设备与材料如下：3.1 冰箱：0 4。3.2 恒温培养箱：36 2、45 2。3.3 显微镜：10 100。3.4 全自动细菌生化鉴定系统。3.5 均质器。3.6 过滤装置：抽滤瓶、真空泵和耐高温处理的过滤器。3.7 天平：感量 0.1 g。3.8 酒精灯和接种环。3.9 无菌剪刀、勺子、镊子。3.10 无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。3.11 滤膜：直径 47 mm,微孔径 0.45 mm0.02 mm。3.12 无菌试管：18 mm180 mm、15mm100 mm 及相应的试管架。3.13 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL 具 0.1 m
3、L 刻度）。3.14 无菌锥形瓶:容量 500 mL。3.15 无菌培养皿：直径 90 mm。4 培养基和试剂 4.1 叠氮化钠葡萄糖肉汤:按附录中 A.1。4.2 肠球菌肉汤:按附录中 A.2。4.3 KF 链球菌琼脂:按附录中 A.3。4.4 肠球菌琼脂（胆汁七叶苷叠氮钠琼脂）:按附录中 A.4。4.5 胆汁七叶苷琼脂（BEA 琼脂）:按附录中 A.5。4.6 脑心浸液肉汤(BHIB):按附录中 A.6。DBS22/0272014 2 4.7 含 6.5%氯化钠脑心浸液肉汤:按附录中 A.7。4.7.1 脑心浸液琼脂(BHIA):按附录中 A.8。4.7.2 过氧化氢酶试验：按附录中 A.
4、9。4.7.3 革兰氏染色液按附录中 A.10。4.7.4 Vitek GNI全自动微生物生化鉴定系统测试卡或 API 20strep 试剂条。（由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标本的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。）第第一法一法 平板计数法平板计数法 5 平板计数法实验原理 应用倾注法，根据样液在选择性肠球菌琼脂（36 2 培养18 h24 h）或KF琼脂（36 2 培养24 h 48h）上生长的典型菌落数，经确证实验证实为肠球菌的菌落数可换算为每克或每毫升样本中肠球菌数。此方法适用与未经加工处理的生鲜食
5、品或污染情况可能较重的水和食品。6 平板计数法检验程序 平板计数法检验程序如图 1：检样25 g(mL)样品225 mL 生理盐水，均质10 倍系列稀释选择2 个3 个适宜稀释度，各取1 mL分别加入肠球菌琼脂或KF琼脂36 2 24 h48 h菌落观察染色镜检生化实验或Vitek 或API 计数并报告结果确证实验检样25 g(mL)样品225 mL 生理盐水，均质10 倍系列稀释选择2 个3 个适宜稀释度，各取1 mL分别加入肠球菌琼脂或KF琼脂36 2 24 h48 h菌落观察染色镜检生化实验或Vitek 或API 计数并报告结果确证实验 图 1 肠球菌平板计数法检验程序 7 平板计数法操
6、作步骤 DBS22/0272014 3 7.1 样品保存 采样后应尽快进行检验，若不能及时检验，应放于18 左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。若不能及时检验，应冷藏保存的待检样品在运送实验室后应1 4 冰箱保存。样品采集后8 h内要完成检验。7.2 样品处理 7.2.1 固态样品：以无菌操作称取 25 g 检样，放入含有 225 mL 灭菌生理盐水的无菌均质杯或均质袋或灭菌乳钵中，使用旋转刀片式均质器均质(8001000 r/min)2 min 或拍击式均质器均质 2 min 或充分研磨做成 1:10 稀释液。7.2.2 液态样品：以无菌操作量取 25 mL 检样，放入含有 225
7、 mL 灭菌生理盐水的无菌均质杯或均质袋中，振荡混匀。7.2.3 样品稀释：取 1:10 稀释液 1 mL 加到含有 9 mL 无菌生理盐水的稀释瓶中,充分混匀制成 1:100的稀释液。根据对样品的污染状况的估计,依次制成十倍递增稀释样品匀液。每递增稀释 1 次,换用 1 支1 mL 无菌吸管或吸头。7.3 定量检测 7.3.1 接种和培养 根据样品的污染程度估计，选择2个3个连续的适宜稀释度的稀释液各1 mL加入无菌培养皿内,每个稀释度做2个平皿。把融化45 1 的肠球菌琼脂或KF琼脂12 mL15 mL倾入培养皿内，转动平板充分混合，水平放置，使琼脂凝固。可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层肠球
8、菌琼脂或KF琼脂（约4mL），凝固后翻转平板。肠球菌琼脂置于36 2 培养18 h24 h；KF平板置于36 2 培养24 h 48h。同时分别取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。7.3.2 典型菌落观察 在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落；在KF平板上形成暗红色至粉红色菌落，边缘整齐，用无菌接种针从每个肠球菌琼脂平板或KF平板挑取5个典型菌落，进一步做确证实验。7.3.3 革兰氏染色镜检 在肠球菌琼脂平板或KF平板上挑取典型菌落作革兰氏染色镜检，鉴定为革兰氏阳性球菌。7.3.4 确证实验 7.3.4.1 纯培养 将肠球菌琼脂平板或KF平板上的革兰氏阳性球菌的典型菌落分别
9、接种到脑心浸液肉汤（BHIB）和葡萄糖琼脂斜面或脑心浸液琼脂（BHIA）斜面。BHIB肉汤置于 36 2培养24h,葡萄糖琼脂斜面和BHIA斜面置于 36 2 培养24 h48 h。7.3.4.2 生化实验 将培养后的BHIB肉汤或斜面分别接种到胆汁七叶苷琼脂（BEA）平板和含6.5%氯化钠的BHIB 肉汤，置于36 2培养24 h48 h，观察细菌生长情况。如果BEA平板上生长并水解七叶苷（形成黑色或棕色沉淀），6.5%氯化钠的BHIB肉汤中36 2培养24 h48 h生长良好，则可确证为肠球菌。也可以采用API 试剂条或Vitek 鉴定试卡进行生化鉴定。8 平板计数法结果计算 DBS22/
10、0272014 4 选择有典型肠球菌菌落的平板，且同一稀释度2个平板所有菌落数合计在20 CFU200 CFU 之间，计数典型菌落数。如果：a)只有一个稀释度的平板菌落数在 20 CFU200 CFU 之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b)所有稀释度的平板菌落数均小于 20 CFU 且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；c)某一稀释度的平板菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d)若所有稀释度的平板菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；e)若所有稀释度的平板菌落数均
11、不在 20 CFU200 CFU 之间且有典型菌落，其中一部分小于 20 CFU 或大于 200 CFU 时，应计数最接近 20 CFU 或 200 CFU 的稀释度平板上的典型菌落。以上情况按公式（1）计算。公式（1）：T=dCBA （1）式中：T样品中肠球菌菌落数；A某一稀释度肠球菌典型菌落的总数；B鉴定结果为肠球菌的菌落数；C用于肠球菌鉴定的菌落数；d 稀释因子。f）若2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU200 CFU 之间，按公式（2）计算 公式（2）：（2）式中：T 样品中肠球菌的菌落数；A1第一稀释度（低稀释倍数）肠球菌典型菌落的总数；A2第二稀释度（高稀释倍数）肠球菌典型
12、菌落的总数；B1第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为肠球菌的菌落数；B2第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为肠球菌的菌落数；C1第一稀释度（低稀释倍数）用于肠球菌鉴定的菌落数；C2第二稀释度（高稀释倍数）用于肠球菌鉴定的菌落数；1.1计算系数（如果第二稀释度肠球菌鉴定结果为0，计算系数采用1）；d 稀释因子（第一稀释度）。9 平板计数法结果报告 根据样品的取样量和稀释度，按7 中公式计算，报告样品中肠球菌的菌落数，以CFU/g(mL)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。第二法第二法 肠球菌的肠球菌的 MPN 计数计数法法 10 MPN 计数法实验原理 d.11222111CBACBA
13、TDBS22/0272014 5 应用MPN 9管法，选择三个适宜的连续稀释度的样液接种于叠氮化钠葡萄糖肉汤和肠球菌肉汤，进行选择性增菌，经确证实验证明含有肠球菌的对应管计为阳性管，查MPN表，计数并报告每克或每毫升样品中肠球菌的MPN值。此方法适用于污染程度较低的样品。11 MPN 计数法的检验程序 MPN计数法的检验程序见图2 查MPN表检样25 g(mL)样品225 mL 生理盐水，均质10 倍系列稀释选择3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度各取1 mL分别接种于3管叠氮化钠葡萄糖肉汤或肠球菌肉汤，共9管36 2或 45 224 h48 h菌落观察染色镜检生化实验或Vitek 或API 变
14、黑或混浊不变黑或无混浊肠球菌阴性确证实验报告结果查MPN表检样25 g(mL)样品225 mL 生理盐水，均质10 倍系列稀释选择3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度各取1 mL分别接种于3管叠氮化钠葡萄糖肉汤或肠球菌肉汤，共9管36 2或 45 224 h48 h菌落观察染色镜检生化实验或Vitek 或API 变黑或混浊不变黑或无混浊肠球菌阴性确证实验报告结果 图 2 肠球菌 MPN 计数法的检验程序 12 MPN 计数法操作步骤 12.1 样品保存与处理 同 6.1 和 6.2。12.2 样品接种与培养 根据样品污染情况的估计，选择适宜的3个连续稀释度，每一稀释度分别接种3 管叠氮化钠葡萄糖
15、肉汤或肠球菌肉汤，每管接种1ml样液(如接种样液量超过1 ml则应接种于双料叠氮化钠葡萄糖肉汤活或双料SF肉汤管中)，混匀，共9管。叠氮化钠葡萄糖肉汤置于361培养18 h24 h，检查各试管混DBS22/0272014 6 浊情况；肠球菌肉汤 置于36 1培养 24 h48 h；肉眼观察颜色变为黑色或混浊的试管，表明有肠球菌生长。12.3 接种选择性平板 对所有呈现混浊的叠氮化钠葡萄糖肉汤或颜色变为黑色的肠球菌肉汤进行确证试验。用接种环将各管的培养物划线接种于肠球菌琼脂平板或KF琼脂平板。肠球菌琼脂平板置于36 1 培养18 h24 h；KF琼脂平板置于36 1 培养24 h48 h。12.
16、4 典型菌落观察与确证实验 肠球菌在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落；在KF平板上形成暗红色至粉红色菌落，边缘整齐。用无菌接种针从每个肠球菌琼脂平板或KF平板至少挑取5个典型菌落。按6.3.3 和6.3.4 所述做进一步的确证实验。可以采用 API 试剂条或 Vitek 试卡进行生化鉴定。13 MPN 计数法结果计算 如一管培养物中所挑取的典型菌落中，有一个确认为肠球菌，则该管应视为阳性。根据样品接种量、稀释倍数以及确证阳性的反应管数，查MPN值表（参见附录B），得出样品中肠球菌最近似值。14 MPN 计数法结果报告 报告样品中肠球菌的MPN值，以MPN/g(mL)表示。第三法第三法 肠球菌的滤膜检测法肠球菌的滤膜检测法 15 滤膜检测法实验原理 将滤膜置于选择性培养基上增养时，肠球菌菌落呈现特异的颜色。经过肠球菌确证实验之后，计数并计算滤膜上确证肠球菌菌落的数量，即可计算出样品中肠球菌的数量。本方法适用于水和液体样品中肠球菌的检验。16 滤膜检测法操作程序 滤膜检测法的操作程序见图3 DBS22/0272014 7 检样25 mL样品225 mL 生理盐水10 倍系列稀释选择
